Regulation of AMPA receptor function and synaptic localization by stargazin and PSD-95 [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Barbara Cokić

Barbara Cokic

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• Biologie

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 42
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 22 Mo

Extrait

Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
der Fakult¨at fur¨ Biologie
der Ludwig-Maximilian Universit¨at Munc¨ hen
Regulation of AMPA receptor function
and synaptic localization
by stargazin and PSD-95
vorgelegt von
Barbara Coki´c
Munc¨ hen, Februar 2009
iErstgutachter: Prof. Dr. Tobias Bonhoeffer
Zweitgutachter: Prof. Dr. Andreas Herz
Tag der mu¨ndlichen Pru¨fung: 30.03.2009
iiTo my beloved family
iiiivDievorliegendeArbeitwurdezwischenSeptember2005undJanuar2009unterderLeitung
vonDr. ValentinSteinamMax-PlanckInstitutfur¨ NeurobiologieinMartinsrieddurchgefuh¨ rt.
vviEhrenw¨ortliche Versicherung:
Ich versichere hiermit ehrenw¨ortlich, dass ich die Dissertation mit dem Titel ”Regulation
of AMPA receptor function and synaptic localization by stargazin and PSD-95” selbst¨andig
und ohne unerlaubte Beihilfe angefertigt habe. Ich habe mich dabei keiner anderen als der
von mir ausdruc¨ klich bezeichneten Hilfen und Quellen bedient.
Erkl¨arung:
Hiermit erklare¨ ich, dass ich mich nicht anderweitig einer Doktorpruf¨ ung ohne Erfolg
unterzogen habe. Die Dissertation wurde in ihrer jetzigen oder ahn¨ lichen Form bei keiner
anderen Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Pruf¨ ungszwecken gedient.
Mu¨nchen, im Februar 2009
Barbara Cokic
viiviiiContents
1 Summary 1
2 Abbreviations 5
3 Introduction 7
3.1 Excitatory synapses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
3.2 AMPA receptors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.3 Pharmacology of AMPA receptors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.4 Transmembrane AMPA receptor regulatory proteins (TARPs) . . . . . . . . . 16
3.5 NMDA receptors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.6 Membrane-associated guanylate kinases (MAGUKs) . . . . . . . . . . . . . . 19
3.7 Hipppocampal preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.8 Summary of aims . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
4 Material and Methods 25
4.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.1.1 Chemicals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.1.2 Media and solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.2 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.2.1 General cloning methods. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.2.2 In vitro transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.2.3 Xenopus oocytes preparation and injection . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.2.4 Two-electrode voltage clamp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.2.5 Surface labeling of oocytes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.2.6 Organotypical hippocamapal slice preparation . . . . . . . . . . . . . . 31
ixContents
4.2.7 Preparation of Semliki Forest virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.2.8 Infection of hippocampal cultured slices . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
4.2.9 Electrophysiology in slice culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
4.2.10 Fixation and confocal microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5 Results 37
5.1 Effect of stargazin on AMPA receptor antagonism . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.1.1 Effect of stargazin on GluR1 inhibition by CNQX, GYKI and CP . . 37
5.1.2 Dependence of increased GluR1 sensitivity on the desensitization . . . 40
5.1.3 Effect of stargazin on GYKI- and CP-insensitive GluR1 mutants . . . 41
WT5.1.4 Inhibition of GluR2 and GluR2 GYKI- and CP-insensitive mutants 42
WT5.1.5 Glutamate-dose response of GluR1 and GluR1 insensitive mutants 44
5.1.6 Surface expression of GluR1 insensitive mutants . . . . . . . . . . . . 45
5.2 Regulation of synaptic function by PSD-95 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.2.1 Simultaneous recordings from two cells in slice . . . . . . . . . . . . . 48
5.2.2 EffectofPSD-95overexpressiononsynapticAMPAandNMDAcurrents 50
5.2.3 Presynaptic effects of PSD-95 overexpression . . . . . . . . . . . . . . 57
5.2.4 Postsynaptic effects of PSD-95 overexpression . . . . . . . . . . . . . . 60
5.2.5 Mechanism of PSD-95 effect on synaptic AMPA and NMDA receptors 63
5.2.6 Rectification properties of PSD-95 overexpressing synapses . . . . . . 69
6 Discussion 73
6.1 Stargazin modulates AMPA receptors antagonism . . . . . . . . . . . . . . . 73
6.1.1 Stargazin changes CNQX into partial agonist . . . . . . . . . . . . . . 74
6.1.2 Stargazin changes the antagonism of GYKI and CP . . . . . . . . . . 75
6.1.3 Increased GYKI sensitivity is independent from desensitization . . . . 76
6.1.4 Stargazin restores sensitivity of insensitive mutants . . . . . . . . . . . 77
6.1.5 Ectodomain of stargazin modulates antagonist affinity . . . . . . . . . 77
6.1.6 Insensitive mutants show altered glutamate dose-response curves . . . 78
6.1.7 Insensitive mutants show reduced surface expression . . . . . . . . . . 79
6.2 PSD-95 regulates synaptic function in hippocampal neurons . . . . . . . . . . 81
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