Regulation of endocytosis and secretion by Rab GTPase activating proteins [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Alexander Haas

Alexander K. Haas

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• Biologie

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 26
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

Regulation of endocytosis
and secretion by Rab
GTPase activating proteins





Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
der Fakultät für Biologie
der Ludwigs-Maximilians-Universität München




vorgelegt von

Alexander Haas

München 2008
1. Gutachter: PD Dr. Angelika Böttger
2. Gutachter: Prof. Dr. Michael Schleicher

Tag der mündlichen Prüfung: 17.06.2008
Ehrenwörtliche Versicherung und Erklärung über frühere
Promotionsversuche



Hiermit versichere ich, Alexander Haas, ehrenwörtlich, dass die vorgelegte Dissertation von
mir selbständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt ist. Des Weiteren erkläre ich, dass die
vorgelegte Dissertation weder ganz noch in wesentlichen Teilen einer anderen
Prüfungskommission vorgelegt wurde. Ich habe mich anderweitig keiner Doktorprüfung
unterzogen.






München, 13. Februar 2008

__________________________

Alexander Haas
“All there is to thinking (…) is seeing something noticeable which makes you see something
you weren’t noticing which makes you see something that isn’t even visible.”

Norman Maclean
Zusammenfassung
Vesikulärer Transport ist ein hochgradig regulierter Prozess. Eine Schlüsselfunktion
übernehmen hierbei Proteine der Rab Familie, die mit 60 Mitgliedern die größte Gruppe
innerhalb der Ras Superfamilie kleiner monomerer GTPasen darstellt. Rabs rekrutieren als
Effektoren bezeichnete Proteine zur Membran von Organellen, deren Identität sie hierdurch
definieren. Rabs können sowohl in einer aktiven, GTP gebundenen, als auch in einer
inaktiven Gestalt, gebunden an GDP, auftreten. Eine Schlüsselfunktion in ihrer Regulation
kommt RabGAPs zu, die katalytisch die Hydrolyse gebundenen GTPs beschleunigen.
Durch Datenbankanalyse wurden im humanen Genom 40 dieser GAPs, die durch
eine TBC Domäne charakterisiert sind, identifiziert. Um spezifische Rab-RabGAP Paare
erkennen zu können, wurde ein neuartiges Hefe-Hybrid Verfahren entwickelt. Mittels dieses
Verfahrens wurde ein RabGAP-5 benanntes GAP identifiziert, das spezifisch die GTP
Hydrolyse durch Rab5 stimulierte. Die Expression von RabGAP-5 führte zur Inaktivierung
von Rab5 und dem Verlust des Rab5 Effektors EEA1 von Endosomen. RabGAP-5 war des
Weiteren in der Lage, die von Rab5 abhängige Aufnahme von EGF und Transferrin zu
blockieren. Die Depletion von RabGAP-5 führte durch die erhöhte Menge von GTP
gebundenem Rab5 zu vergrößerten Endosomen und blockierte den Transport von EGF.
Um im Weiteren an der Regulation der Sekretion beteiligte Rabs und ihre GAPs zu
identifizieren, wurde eine neue Methode etabliert, die es, basierend auf der Inaktivierung von
endogenen Rabs durch Expression ihrer GAPs, ermöglicht, beide Partner zugleich zu
erkennen.
Mittels dieses Verfahrens wurde der Einfluss von RabGAPs auf den Golgi Apparat,
das ERGIC und die Sekretion untersucht. Dies führte zur Identifikation von TBC1D20 als
alleinigem gemeinsamem Regulator dieser Prozesse und Organellen, einem hochgradig
konservierten Protein. Dieses Protein stimulierte die GTP Hydrolyse sowohl durch Rab1 als
auch durch Rab2, und reguliert in vivo in erster Linie Rab1. Als einziges RabGAP besitzt
TBC1D20 eine Transmembran-Domäne, durch die es im ER verankert wird. Hier interagiert
TBC1D20 mit RTN-1, welches seine Aktivität moduliert.
Diese Ergebnisse zeigen eine bisher unbekannt Funktion von Rab1 bei der
Regulation von Prozessen auf der Ebene des ER auf. Des Weiteren wird das klassische Bild
von RabGAPs als Regulatoren der Lebensspanne aktiver, GTP gebundener Rab GTPasen,
durch diese Ergebnisse erweitert.
I

Abstract
Vesicle traffic in eukaryotic cells is a tightly organized process involving a multitude of
regulatory proteins. Key regulators of this traffic are small GTPases called Rabs. With about
60 members in the human genome, they constitute the largest subgroup in the superfamily of
Ras like monomeric GTPases. They recruit effector proteins to specific membranes and thus
define the identity of organelles. Rabs switch between an active, GTP bound state and an
inactive GDP bound state. Key regulators of this conversion are RabGAPs, which accelerate
the hydrolysis of bound GTP. All RabGAPs are characterized by the presence of a TBC
domain.
In the human genome 40 RabGAPs were identified, most of which had not been
studied so far. To assign them to their specific Rab proteins, a novel reverse yeast two-
hybrid screening method was developed. This identified a GAP for Rab5 termed RabGAP-5.
RabGAP-5 stimulated the GTPase activity of Rab5. Its expression inactivated Rab5 and
redistributed the Rab5 effector EEA1 from early endosomes to the cytoplasm. RabGAP-5
also blocked the Rab5 dependent uptake of EGF and transferrin from the plasma membrane.
When RabGAP-5 was depleted, the size of endosomes was increased, indicating elevated
Rab5-GTP levels. Endocytosed EGF was unable to exit the endosome, indicating that
trafficking through endosomes was also blocked.
To identify GAPs and Rabs implicated in the regulation of early secretory events
simultaneously, a second novel screening method was established. It involved the analysis of
phenotypes caused by the inactivation of endogenous target Rabs via the overexpression of
RabGAPs.
Changes in Golgi morphology, ERGIC organisation and the proceeding of secretion
were only observed with one candidate RabGAP, the highly conserved protein TBC1D20.
TBC1D20 showed activity towards Rab1 and Rab2 in vitro, and acted primarily on Rab1 in
vivo. In contrast to all other RabGAPs it has a transmembrane domain, which localises it to
the ER. TBC1D20 interacts with RTN-1 on ER membranes. This interaction modulates the
activity of TBC1D20.
These data indicate a novel function for Rab1 in regulating ER exit, and thus extend the
classical view of RabGAPs as regulators of active Rab lifetime.
II
Index
Zusammenfassung_________________________________________________________ I
Abstract _________________________________________________________________II
1 Introduction __________________________________________________________ 6
1.1 Intracellular membrane trafficking ________________________________________ 6
1.1.1 Organelles and vesicle trafficking ________________________________________________ 6
1.1.2 Trafficking pathways 6
1.1.3 Vesicle trafficking has defined stages _____________________________________________ 8
1.2 Small GTPases and membrane traffic _____________________________________ 10
1.2.1 The G domain ______________________________________________________________ 10
1.2.2 GTPases function as molecular switches__________________________________________ 11
1.2.3 s in vesicle trafficking__________________________________________________ 12
1.2.4 Rab GTPases _______________________________________________________________ 12
1.2.5 Rabs define membrane compartments____________________________________________ 14
1.2.6 Rabs modulate multiple steps in vesicular trafficking________________________________ 15
1.2.7 The classic Rab Cycle ________________________________________________________ 16
1.3 RabGAPs regulate GTP hydrolysis by Rabs 18
1.3.1 The TBC domain____________________________________________________________ 18
1.3.2 The GTP hydrolysis reaction___________________________________________________ 19
1.3.3 Open questions about Rab and their GAPs ________________________________________ 21
2 Regulation of endocytosis by RabGAP-5 __________________________________ 22
2.1 Aim of this Work ______________________________________________________ 22
2.2 Results _______________________________________________________________ 22
2.2.1 Bioinformatic identification and characterisation of human RabGAPs __________________ 22
2.2.2 Cloning of human RabGAPs 24
2.2.3 Yeast two-hybrid screening to identify RabGAPs regulating endocytosis ________________ 24
2.2.4 RabGAP-5 specifically activates GTP hydrolysis by Rab5____________________________ 27
2.2.5 RN-tre is a specific Rab43 GAP ________________________________________________ 28
2.2.6 RabGAP-5 redistributes Rab5 effectors in vivo_____________________________________ 30
2.2.7 RabGAP-5 causes redistribution of Rab5 _________________________________________ 32
2.2.8 RN-tre does not function as a GAP for Rab5 in vivo_________________________________ 34
2.2.9 Expression of RabGAP-5 blocks the endocytosis of EGF 35
2.2.10 RabGAP-5 blocks transferrin receptor trafficking ________________________________ 37
2.2.11 RabGAP-5 is an essential regulator of Rab5 ____________________________________ 39
2.2.12 Elevated levels of Rab5 cause a phenotype resembling RabGAP-5 depletion ___________ 42
2.2.13 Depletion of RabGAP-5 blocks trafficking through early endosomes _________________ 42
2.3 Summary _____________________________________________________________ 45
3 Regulation of secretion by TBC1D20 _____________________________________ 46
3.1 Aim of this