Regulation of hepatitis C virus translation by the viral internal ribosome entry site and the 3'-untranslated region [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Yutong Song

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• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 9
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Naturwissenschaftlichen Fachbereiche
Biologie, Chemie und Geowissenschaften
im Fachbereich Biologie
der Justus-Liebig-Universität Giessen






Vorgelegt von

Yutong Song

M.Sc.-Virology




Biochemisches Institut
der Medizinischen Fakultät
der Justus-Liebig-Universität Giessen


Giessen, Januar 2006


Regulation of Hepatitis C Virus translation
by the viral internal ribosome entry site
and the 3´-untranslated region















Supervisors:
Prof. Dr. Albrecht Bindereif
Institute of Biochemistry Faculty ofBiology
Justus-Liebig-University-Giessen
HDoz. Dr. Michael Niepmann
Institute of Biochemistry Faculty of Medicine
Justus-Liebig-University-Giessen ________________________________________________________________________
This work was accomplished from December 2001 to November 2005 under the supervision of HDoz. Dr.
Michael Niepmann in the group of Prof. Dr. Ewald Beck in the Institute of Biochemistry, Faculty of
Medicine, Justus-Liebig-University Giessen.

Acknowledgements

I would like to specially thank my direct supervisor HDoz. Dr. Michael Niepmann for his constant support,
excellent guidance and creative discussions which were the key to my success on the study. Moreover, it is
his encouragement and valuable suggestions that gave me motives and inspiration to make progress in my
scientific research.
I would like to express my sincere thanks to Prof. Dr. Ewald Beck who has also invested a great effort in
my work for his support and scientific supervision. Simultaneously, I am greatly indebted to Charlotte Beck
for her personal care and kind support to my family.
Further I would like to thank Prof. Dr. Albrecht Bindereif for the co-supervision of this work and for his
instructive advice and his great help on my study, as well as for his cooperation in the hnRNP L project.
I would like to thank my colleagues who create together such a nice atmosphere in the lab: Eleni Tzima,
Christiane Jünemann, Barbara Preiss, Ralf Füllkrug, Michael Heimann, Pilar Hernández-Pastor, Dajana
Henschker, Jochen Wiesner, Martin Hintz, René Röhrich, Nadine Englert, Hassan Jomaa and also other
colleagues in the research groups of Prof. Dr. K. T. Preissner and Prof. Dr. R. Geyer at the Institute of
Biochemistry. I express also my special thanks to my former colleagues Dr. Gergis Bassili and Amandus
Zeller who were always ready to share their experiences with me, and often created an amicable occasion
via their distinctive hearty spirit in our group. I have learned a lot from them at the beginning of my Ph.D.
study. My sincere thanks also go to my former colleagues: Dr. Ann-Kristin Kollas, Dr. Boran Altincicek,
and Frau Ursula Jost.
Also I want to thank Dr. Dieter Glebe, Dr. Michael Kann and Dr. Sandip Kanse who generously provided
to me some mammalian cell lines (mentioned in section 2.1 Materials) and Silke Schreiner for the
preparation of hnRNP L protein. I would like to thank my Chinese friends Jingyi Hui and Wenjun Ma for
their kind help during my work.
I offer my thanks to the following academic programs that helped me to be in touch with life science, the
Ph.D. Program (Graduiertenkolleg) "Biochemie von Nukleoproteinkomplexen" and the Sonderforschungs-
bereich 535 (Collaborative Research Center) "Invasionsmechanismen und Replikationsstrategien von
Krankheitserregern", which are founded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German National
Science Foundation) for the financial support.
I am forever indebted to my mother and my younger sister for providing me a sustained understanding and
encouragement. Finally, I am forever grateful to my beloved wife for her love with great cordiality, her
quietly unselfish support and her meticulous cares which are always with me whenever I need. I
I Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurde die Regulation der Translation des Hepatitis C Virus (HCV) durch die Interne
Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) und die 3´-untranslatierte Region (3´-UTR) untersucht. Die 3´-UTR
stimuliert die Translation, und einige bekannte zelluläre RNA-bindende Proteine wie auch ein neu
entdecktes 210 kDa-Protein binden an die 3´-UTR und sind möglicherweise an der Regulation der
Translation von HCV beteiligt.
HCV, der Erreger der non-A, non-B-Hepatitis (NANBH), ist einziger Vertreter des Genus Hepacivirus in
der Familie Flaviviridae. HCV hat mehr als 170 Millionen Menschen infiziert. Etwa 80 % von ihnen sind
nicht in der Lage, das Virus zu eliminieren, und tragen ein hohes Risiko, chronische Leberkrankheiten wie
Zirrhose und Hepatozelluläres Karzinom zu entwickeln. Ein seit kurzem verfügbares Replikon-System hat
die HCV-Forschung stark beschleunigt, aber es gibt noch kein Zellkultursystem, das einen kompletten
Infektionszyklus von HCV erlaubt, ein Umstand, der die Untersuchung des viralen Lebenszyklus wie auch
die Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten noch erheblich verlangsamt.
In dieser Arbeit wurde die Interaktion einiger bekannter zellulärer RNA-bindender Proteine, des
Polypyrimidine Tract-Binding Protein (PTB), des heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein L (hnRNP L)
und des Proteins, das "upstream of N-ras" codiert wird (Unr), mit der HCV IRES und der 3´-UTR
untersucht. PTB bindet nicht an die IRES, aber an die 3´-UTR. Im Gegensatz dazu bindet hnRNP L nur an
die IRES. Darüber hinaus fördert hnRNP L die Bindung von PTB an die 3´-UTR, was darauf hindeutet,
dass beide Proteine synergistisch an die HCV-RNA binden. Allerdings konnte nur eine sehr geringe
Stimulation der HCV-Translation durch hnRNP L in vitro festgestellt werden. Auch rekombinantes Unr-
Protein bindet an die HCV 3´-UTR, aber in den hier durchgeführten in vitro-Experimenten konnte kein
signifikanter Effekt auf die Translation festgestellt werden.
Aufgrund etlicher widersprüchlicher Berichte über eine mögliche Funktion der HCV 3´-UTR bei der
Translation wurde hier festgestellt, dass mehrere Aspekte der Struktur der Reporter-Konstrukte wichtige
Parameter beim Test der Funktion der 3´-UTR sind. Die 3´-UTR stimuliert die Translation nur dann, wenn
monocistronische Reporter-mRNAs mit einem präzisen, authentischen 3´-Ende der 3´-UTR verwendet
werden. Diese Stimulation ist stärker in Zelllinien, die von Leberzellen abgeleitet sind, als in anderen
Zelllinien. In der 3´-UTR sind die Variable Region, der poly(U/C)-Trakt und der am weitesten 3´-terminal
gelegene Stem-Loop 1 der hoch-konservierten 3´-X-Region für die Stimulation wichtig, weniger aber die
Stem-Loops 2 und 3. Die Signale für die Stimulation der Translation überlappen also zum Teil mit denen
für die Initiation der RNA-Minusstrang-Synthese, so dass diese Sequenzen möglicherweise zusammen mit
viralen und/oder zellulären Proteinen an einer Interaktion der 5´- und 3´-Enden des viralen Genoms und
einer Umschaltung von der Translation zur RNA-Minusstrang-Synthese beteiligt sind.
Die Suche nach Proteinen, die an der Translations-Initiation von HCV beteiligt sind, ergab zunächst kein
neues Protein, das an die HCV IRES bindet. Aufgrund des Befundes dieser Arbeit, dass die 3´-UTR die
Translation stimuliert, wurde dann eine Regulation der Translation auch durch Proteine, die an die 3´-UTR
binden, erwogen. Deshalb wurde das Design der Reporter-Konstrukte überdacht, mit dem Resultat, dass ein
bisher unbekanntes Protein entdeckt wurde, das spezifisch an die HCV-RNA bindet. Dieses 210 kDa-
Protein bindet an die Variable Region der 3´-UTR nur dann, wenn eine RNA mit einem authentischen 3´-
Ende der 3´-UTR verwendet wird. Dies legt die Vermutung nahe, dass das 210 kDa-Protein möglicher-
weise im Zusammenhang mit der Termination der Translation an die HCV-RNA oder an das Ribosom
bindet und an der Umschaltung von der Translation zur RNA-Minusstrang-Synthese beteiligt ist. II
II Summary

In this study, the regulation of translation of Hepatitis C Virus (HCV) by the internal ribosome entry site
(IRES) and the 3´-untranslated region (3´-UTR) was investigated. The 3´-UTR stimulates HCV IRES-
directed translation, and some known cellular RNA-binding proteins as well as a newly discovered 210
kDa protein specifically binding to the 3´-UTR may be involved in HCV translation regulation.
HCV, the main causative agent of non-A, non-B hepatitis (NANBH), belongs to the unique genus
Hepacivirus in the family Flaviviridae. HCV has infected more than 170 million people worldwide, about
80 % of whom are unable to eliminate the virus, and those are at high risk to develop chronic liver diseases
including cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The recent development of replicon systems has largely
accelerated HCV research, but there is still no tissue culture system supporting a complete replication cycle
of HCV, a circumstance that