Rôle de ERK dans l
173 pages
Français
Obtenez un accès à la bibliothèque pour le consulter en ligne
En savoir plus

Rôle de ERK dans l'activation des osmorécepteurs hypothalamiques

-

Obtenez un accès à la bibliothèque pour le consulter en ligne
En savoir plus
173 pages
Français

Description

Sous la direction de Daniel Voisin
Thèse soutenue le 27 novembre 2009: Bordeaux 2
La vasopressine (VP), hormone anti-diurétique, joue un rôle fondamental dans l’homéostasie des compartiments liquidiens de l’organisme. Ainsi, la concentration de VP libérée dans la circulation sanguine est proportionnelle à l’osmolalité plasmatique. Or, la libération de la VP est étroitement dépendante de l’activité électrique des neurones magnocellulaires hypothalamiques (MNCs) qui la synthétisent. L’activité électrique des MNCs est donc régulée lors de variations de l’osmolalité plasmatique. Cette régulation implique la modulation concertée de propriétés intrinsèques dépendant de l’expression de canaux ioniques mécanosensibles, mais aussi d’entrées synaptiques excitatrices provenant de structures cérébrales osmosensibles. Les Extracellular signal-regulated kinases (ERK 1 et 2) sont des protéines de la voie des MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases) qui convertissent des stimulus extracellulaires en réponses intracellulaires transcriptionnelles et post-traductionnelles. Elles contribuent en particulier à la plasticité des propriétés membranaires intrinsèques et des synapses excitatrices glutamatergiques dans le système nerveux central. Elles sont exprimées par les MNCs de l’hypothalamus. L’objet de ce travail de thèse a été l’étude du rôle de ERK dans l’activation des osmorécepteurs hypothalamiques. Les expériences d’immunohistochimie montrent qu’en réponse à une stimulation systémique hypertonique, la voie ERK 1/2 est activée rapidement, de façon transitoire et sélectivement dans des structures osmoréceptrices de l’encéphale ou directement impliquées dans l’osmorégulation : noyaux supraoptiques (NSO) et paraventriculaires (NPV), organe subfornical, noyau préoptique médian et OVLT. ERK est aussi activée dans la portion parvicellulaire du NPV, mais pas dans une structure témoin qui ne participe pas à l’osmorégulation, la strie médullaire thalamique. De plus, il existe un codage de l’intensité de la stimulation osmotique par le nombre de neurones exprimant phosphoERK dans l’encéphale. Les Western Blot indiquent qu’il existe également un codage de l’intensité du stimulus hypertonique par le degré d’expression de la protéine phosphoERK dans le NSO. Nous montrons aussi qu’il existe une activation plus importante de ERK dans les neurones à VP que dans les neurones à ocytocine. L’ensemble de ces résultats suggère que phosphoERK pourrait contribuer aux mécanismes de l’osmorégulation. Cette hypothèse a été testée en mesurant les effets de l’inhibition de la phosphorylation de ERK sur l’activation des centres osmorégulateurs. Effectivement, l’administration intracérébroventriculaire d’un inhibiteur sélectif de MEK 1/2, l’U 0126, inhibe la phosphorylation de ERK et l’activation neuronale (mesurée par l’expression de Fos) résultant de l’application d’un stimulus hypertonique. La phosphorylation de ERK joue donc un rôle majeur dans l’activation des centres osmorégulateurs de l’encéphale. En accord avec ces données, les enregistrements électrophysiologiques sur tranches d’hypothalamus montrent que ERK est impliqué dans la réponse cellulaire des neurones magnocellulaires à une stimulation osmotique : l’inhibition de la phosphorylation de ERK réduit la dépolarisation membranaire et diminue l’augmentation de la fréquence de décharge des potentiels d’action ainsi que l’augmentation de l’amplitude des potentiels synaptiques spontanés induits par un stimulus hypertonique. Les données obtenues sur les neurones supraoptiques isolés montrent qu’une partie au moins des effets de l’activation de ERK implique une modulation de la conductance membranaire qu’on sait responsable de l’osmotransduction dans ces neurones. En résumé, l’activation de ERK est nécessaire à la réponse normale des neurones magnocellulaires à une stimulation osmotique.
-Erk
-Vasopressine
-Osmotransduction
-Osmorécepteurs
-Hypothalamus
The release of the anti-diuretic hormone vasopressin into the general circulation varies as a function of plasma osmolality and therefore plays a major role in systemic osmoregulation. It is primarily determined by the firing rate of the hypothalamic magnocellular neurons (MNCs). The regulation of MNC firing rate during changes in systemic osmolality involves the concerted modulation of intrinsic mechanosensitive ion channels in these neurons, as well as excitatory glutamatergic inputs derived from osmosensitive forebrain regions. Extracellular signal-Regulated protein Kinases (ERK) are mitogen-activated protein kinases that transduce extracellular stimuli into intracellular post-translational and transcriptional responses, which include changes in intrinsic neuronal properties and synaptic function. In the present work, we investigated whether ERK activation (i.e. phosphorylation) plays a role in the functioning of osmoregulatory networks. First, we found that within 10 minutes of intraperitoneal injections of hypertonic saline (3M, 6M), many phosphoERK-immunopositive neurons were observed within osmosensitive forebrain regions including suparoptic and paraventricular nuclei, subfornical organ, median preoptic nucleus and Organum vasculosum lamina terminalis (OVLT), but not in a control region such as the thalamic stria medullaris. This staining was intensity dependent and was reduced 30 minutes after the stimulus. In the supraoptic nucleus, it predominated in vasopressin neurons compared to oxytocin neurons. Western blotting experiments confirmed that ERK phosphorylation in the supraoptic nucleus was intensity dependent. Inhibition of ERK phosphorylation by a MEK inhibitor reduced both the numbers of phosphoERK-immunopositive neurons and Fos expressing neurons, a measure of neuronal activation after hypertonic stimuli. Inhibition of ERK phosphorylation also decreased the membrane depolarization, the increase in firing frequency and the increase in excitatory and inhibitory synaptic potential amplitude that were osmotically-induced in both oxytocin and vasopressin supraoptic neurons recorded from adult acute hypothalamic slices. It also reduced the increase in mechanically-gated membrane cation conductance evoked by hypertonic stimuli in isolated MNC neurons. Altogether, these findings strongly suggest that ERK phosphorylation is a key step in the transduction and integration of osmotic stimuli into activity changes in osmosensitive hypothalamic neurons.
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21657/document

Sujets

Informations

Publié par
Nombre de lectures 658
Langue Français
Poids de l'ouvrage 116 Mo

Exrait


Université Victor Segalen Bordeaux 2


Année 2009 Thèse n°


THESE
pour le
DOCTORAT DE L’UNIVERSITE BORDEAUX 2


Mention : Sciences Biologiques et Médicales
Option : Neurosciences et Pharmacologie



Présentée et soutenue publiquement
Le 27 Novembre 2009
Par Julien DINE
Né le 10 Novembre 1983 à Lyon (69)



Rôle de ERK dans l’activation des osmorécepteurs hypothalamiques


Directeur de thèse : Dr Daniel VOISIN






JURY


Dr Abdelhamid BENAZZOUZ Président
Dr Charles W. BOURQUE Rapporteur
Dr Vincent PREVOT Rapporteur
Dr Marc LANDRY Examinateur
Dr Yves TILLET Examinateur
Dr Daniel VOISIN Directeur de thèse

1







« L’homéostasie est l’équilibre dynamique
qui nous maintient en vie »

Claude Bernard








2









A mes parents et à ma famille,
























3
































Remerciements









4
Remerciements

Ça y est une dernière page se tourne et la thèse se termine ! Ceci mérite bien
quelques mots ! La thèse, travail personnel par définition, doit son accomplissement à
un travail d’équipe. J’aimerais donc remercier ici toutes les personnes avec qui j’ai
collaboré et qui m’ont soutenu depuis le début de ma courte carrière scientifique,
tant au laboratoire qu’à l’extérieur.

Je voudrais tout d’abord remercier très sincèrement les membres de mon jury
de thèse : Monsieur le Dr. Abdelhamid Benazzouz pour avoir accepté de présider ce
jury et pour avoir été un tuteur de thèse formidable, Messieurs les Dr. Charles
Bourque et Vincent Prévot pour avoir accepté d’être rapporteurs et Messieurs les
Dr. Marc Landry et Yves Tillet pour avoir accepté d’évaluer mon travail de thèse.
Qu’ils trouvent ici le témoignage de ma profonde reconnaissance et de ma gratitude
d’avoir consacré de leur temps à juger ce travail.

Je tenais aussi à exprimer toute ma reconnaissance à mon directeur de thèse,
le Dr. Daniel Voisin pour m’avoir fait confiance et m’avoir accompagné avec
enthousiasme et rigueur durant ces trois années. Je le remercie de m’avoir accueilli
dans son équipe et de m’avoir formé à la recherche scientifique. Daniel, je vous
remercie très sincèrement de m’avoir confié ce projet de thèse passionnant et de
l’avoir réorienté lorsqu’il a fallu le faire, d’avoir partagé votre savoir (qui est
immense !!! comment faites-vous ?). Vous avez su aussi me faire partager votre
passion et votre savoir-faire pour l’enseignement et ce fut pour moi une expérience
très enrichissante tant d’un point de vue personnel que professionnel. Enfin, je tenais
sincèrement à vous remercier pour votre aide formidable lors de l’écriture de ce
manuscript ; vous y avez apporté toute votre rigueur scientifique quand je
m’éparpillais un peu partout… J’espère que ces trois années furent aussi plaisantes
pour vous qu’elles le furent pour moi.

Je tenais à exprimer mes sincères remerciements au Dr. Stéphane Oliet,
directeur de l’équipe « Physiologie intégrée des systèmes neuroendocrines », qui m’a
accueilli au sein de son laboratoire, permis d’effectuer ce travail dans les meilleures
conditions possibles jusqu’à la fin et fais profité de son savoir scientifique.

Je voudrais aussi remercier le Dr. Jean-Marc Israel pour tout ce qu’il a fait
pour moi durant ces trois années. Jean-Marc vous avez été pour moi un mentor, une
sorte de papa dans ce laboratoire et aussi une oreille attentive lorsque j’en ai eu
besoin. Vous m’avez initié et formé à l’enregistrement intracellulaire en sharp, vous
avez partagé avec moi tous vos secrets et vos petites ruses de sioux pour empaler les
MNCs que ce soit sur les tranches organotypiques ou in vivo. Je regrette que nous
n’ayions pas pu travailler plus longtemps ensemble sur les enregistrements in vivo
pour enfin arriver à empaler ces s…aletés de neurones et voir ce qu’ils avaient dans
le ventre…La question reste en suspens. Pour finir, je voudrais vous souhaiter le
meilleur pour la nouvelle vie qui s’offre à vous : profitez bien de votre retraite, vous
l’avez bien mérité. J’espère avoir de vos nouvelles très souvent.

Je tenais aussi à remercier le Dr. Marie-Christine Lombard pour son aide
inestimable de chaque instant, ses conseils et son écoute. Marie, tu es un peu le
McGyver de ce laboratoire ; pour toi il n’y a pas de problèmes, il n’y a que des
5
solutions et un peu de bricolage règle tout çà. J’espère avoir très vite l’occasion de te
revoir et de goûter à nouveau ta super tarte au citron meringuée et ton gâteau au
chocolat.

J’adresse aussi mes sincères remerciements au Dr. Jean-Pierre Mothet qui a
toujours été là pour m’écouter, me conseiller et répondre à mes questions sur le vaste
sujet qu’est la biochimie. Jean-Pierre, nos discussions, qu’elles soient scientifiques ou
non, ont toujours été une grande joie pour moi. Cependant, permet moi de te le dire,
il serait grand temps que tu t’achètes un bon bouquin de blagues en tout genre. En
tout cas, je te souhaite beaucoup de réussite et de bonheur pour la suite de ta
carrière. A très bientôt j’espère.

Je voudrais aussi remercier Frau Magalie Martineau (nouvelement
expatriée au nord de l’Allemagne dans le froid et la neige), qui de collègue de travail
et devenue une amie. Merci pour tous ces bons moments et ces passionnantes
discussions dans la cage aux fauves du labo ou en dehors, le soir après une dure
journée de manip. Je te souhaite plein de réussite pour la suite de ta carrière et plein
de bonheur dans ta vie personnelle. Normalement si tout ce passe bien, nous devrions
nous recroiser en Allemagne.

Je voudrais remercier chaleureusement le Dr. Valérie Fénelon et Thomas
Papouin pour le temps qu’ils ont consacré à la lecture de ce manuscript. Vos
corrections et vos conseils ont été d’une grande aide pour moi. J’espère que cette
lecture ne fut pas trop indigeste pour vous.

Je souhaiterais adresser mes remerciements les plus sincères à Pascal Fossat et
à Vincent Ducourneau pour leur participation et leur investissement car sans eux ce
travail n’aurait pas été le même. Pascal, je te souhaite plein de bonheur avec ta
petite famille et dans ton travail d’enseignant-chercheur. Vincent, tu commences ta
thèse et je te souhaite toute la réussite possible. Valérie, merci de m’avoir transmis la
technique d’immunoidentification des neurones enregistrés en patch-clamp, que tu as
si patiemment mis au point durant ces longs mois.

J’aimerais enfin remercier tous les membres de l’’équipe « Physiologie intégrée
des systèmes neuroendocrines ». Philippe et Dyonisia, pour leurs précieux conseils
sur l’anatomie et l’immunohistochimie, j’ai beaucoup appris grâce à vous. Philippe, je
te remercie aussi pour tes histoires, parfois très salaces, lors de mémorables séances
de montage de coupes sériées. Dominique pour vos précieux conseils sur le SHN et
votre gentillesse. Federico, pour sa disponibilité, sa gentillesse et son aide pendant
ma recherche de post-doc : Forza AS Roma !!! Fabrice, Jérôme, Aurélie, Sabira,
Nathalie et Peggy pour leur bonne humeur quotidienne.

Je voudrais aussi remercier La Société des Neurosciences avec qui j’ai partagé
des supers moments pendant ces trois années. Francis, Clémence, Isabelle et Diane,
merci pour votre gentillesse de chaque instant et votre bonne humeur.

Je voudrais aussi adresser de sincères remerciements aux membres de la
PICIN pour leur aide et leurs précieux conseils concernant le travail de microscopie.
Grâce à eux, j’ai beaucoup appris sur le fonctionnement et l’utilisation des
microscopes. Merci beaucoup Christel et Philippe d’avoir donné de votre temps pour
6
améliorer la qualité de mes images et essayé de faciliter au maximum le travail
d’analyse.

En dehors du laboratoire, j’aimerais remercier les amis fidèles de longue date
ou connus lors de mon arrivée à Bordeaux. Je suis bien conscient de n’avoir pas pu
passer autant de temps que je l’aurais souhaité avec vous, j’espère que vous ne m’en
tiendrz pas trop rigueur. Merci à toi Laurent et surtout bonne chance pour ton post-
doc et la suite de ta carrière, qui sera, j’en suis sûr très fructueuse. Bon vent à Paris
et j’espère que nous resterons en contact. Merci à toi Loïc pour nos discussions
scientifiques et footballistiques autour d’un café-clope. Bon courage pour la suite que
ce soit dans un labo ou ailleurs. Merci aussi à toi Pierrick. Cela fait un bon bout de
temps que nous ne nous sommes pas vu, mais je suis content d’avoir eu de tes
nouvelles régulièrement. Maintenant que cette thèse se termine, je compte bien
monter te voir sur Paris. Je voudrais aussi remercier Mister François pour les bons
moments passés à vouloir refaire le monde autour d’une petite bière à la terrasse
d’un café. J’espère que tu reviendras sur Bordeaux avant que je n’en parte. Je
voudrais aussi remercier toute la Dream Team de l’Asso 2D2B avec qui j’ai partagé
des moments inoubliables que ce soit lors de nos soirées ou sur le terrain de basket du
stade Chaban Delmas. Merci à vous tous Christelle et Xavier (plein de bonheur aux
jeunes mariés), Benoît, Dada, Marion, Charles et Fanny, Claire, Marc et Delphine,
Mathieu et Joanna, Arnaud et Amélie, Seb et Sophie et leur petit (qui ne doit plus
être si petit que çà) Arthur.

Je voudrais aussi remercier mes parents, mon petit frère et toute ma famille
pour m’avoir poussé à entreprendre ces études et m’avoir soutenu tout au long de ces
nombreuses années. Je tenais à m’excuser de n’avoir pas pu être présent aussi
souvent que je l’aurais souhaité lors des nombreuses réunions de famille, mais bon…
c’était pour la bonne cause !

J’aimerais terminer avec un petit mot pour celle qui m’a soutenu au quotidien
ces trois années et qui partage ma vie depuis deux ans maintenant. Tu as toujours
été là pour moi, que ce soit pour fêter des réussites ou consoler des échecs. Tu
m’apportes le bonheur et l’équilibre et sans toi je n’aurais sans doute pas réussi.


A tous un grand merci






7









Résumé










8
Résumé

La vasopressine (VP), hormone anti-diurétique, joue un rôle fondamental dans
l’homéostasie des compartiments liquidiens de l’organisme. Ainsi, la concentration de VP
libérée dans la circulation sanguine est proportionnelle à l’osmolalité plasmatique. Or, la
libération de la VP est étroitement dépendante de l’activité électrique des neurones
magnocellulaires hypothalamiques (MNCs) qui la synthétisent. L’activité électrique des
MNCs est donc régulée lors de variations de l’osmolalité plasmatique. Cette régulation
implique la modulation concertée de propriétés intrinsèques dépendant de l’expression de
canaux ioniques mécanosensibles, mais aussi d’entrées synaptiques excitatrices provenant de
structures cérébrales osmosensibles.
Les Extracellular signal-regulated kinases (ERK 1 et 2) sont des protéines de la voie
des MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases) qui convertissent des stimulus
extracellulaires en réponses intracellulaires transcriptionnelles et post-traductionnelles. Elles
contribuent en particulier à la plasticité des propriétés membranaires intrinsèques et des
synapses excitatrices glutamatergiques dans le système nerveux central. Elles sont exprimées
par les MNCs de l’hypothalamus. L’objet de ce travail de thèse a été l’étude du rôle de ERK
dans l’activation des osmorécepteurs hypothalamiques.
Les expériences d’immunohistochimie montrent qu’en réponse à une stimulation
systémique hypertonique, la voie ERK 1/2 est activée rapidement, de façon transitoire et
sélectivement dans des structures osmoréceptrices de l’encéphale ou directement impliquées
dans l’osmorégulation : noyaux supraoptiques (NSO) et paraventriculaires (NPV), organe
subfornical, noyau préoptique médian et OVLT. ERK est aussi activée dans la portion
parvicellulaire du NPV, mais pas dans une structure témoin qui ne participe pas à
l’osmorégulation, la strie médullaire thalamique. De plus, il existe un codage de l’intensité de
la stimulation osmotique par le nombre de neurones exprimant phosphoERK dans
l’encéphale. Les Western Blot indiquent qu’il existe également un codage de l’intensité du
stimulus hypertonique par le degré d’expression de la protéine phosphoERK dans le NSO.
Nous montrons aussi qu’il existe une activation plus importante de ERK dans les neurones à
VP que dans les neurones à ocytocine. L’ensemble de ces résultats suggère que phosphoERK
pourrait contribuer aux mécanismes de l’osmorégulation.
Cette hypothèse a été testée en mesurant les effets de l’inhibition de la
phosphorylation de ERK sur l’activation des centres osmorégulateurs. Effectivement,
l’administration intracérébroventriculaire d’un inhibiteur sélectif de MEK 1/2, l’U 0126,
9
inhibe la phosphorylation de ERK et l’activation neuronale (mesurée par l’expression de Fos)
résultant de l’application d’un stimulus hypertonique. La phosphorylation de ERK joue donc
un rôle majeur dans l’activation des centres osmorégulateurs de l’encéphale.
En accord avec ces données, les enregistrements électrophysiologiques sur tranches
d’hypothalamus montrent que ERK est impliqué dans la réponse cellulaire des neurones
magnocellulaires à une stimulation osmotique : l’inhibition de la phosphorylation de ERK
réduit la dépolarisation membranaire et diminue l’augmentation de la fréquence de décharge
des potentiels d’action ainsi que l’augmentation de l’amplitude des potentiels synaptiques
spontanés induits par un stimulus hypertonique. Les données obtenues sur les neurones
supraoptiques isolés montrent qu’une partie au moins des effets de l’activation de ERK
implique une modulation de la conductance membranaire qu’on sait responsable de
l’osmotransduction dans ces neurones. En résumé, l’activation de ERK est nécessaire à la
réponse normale des neurones magnocellulaires à une stimulation osmotique.


MOTS-CLES : ERK, vasopressine, osmotransduction, osmorécepteur, hypothalamus










10