Role of cGMP-dependent protein kinase in brown fat cell differentiation [Elektronische Ressource] / von Bernd-Bodo Haas

Bernd-Bodo Haas

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 33
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilians-Universität München









Role of cGMP-dependent protein kinase
in
brown fat cell differentiation



von
Bernd-Bodo Haas
aus Michelstadt


2008












Für meine Familie

Erklärung


Erklärung

Diese Dissertation wurde im Sinne von §13 Abs. 3 bzw. 4 der Promotionsordnung vom 29.
Januar 1998 von Prof. Dr. Alexander Pfeifer betreut.




Ehrenwörtliche Versicherung

Diese Dissertation wurde selbstständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.

München, am 04.06.2008





______________________
Bernd-Bodo Haas










Dissertation eingereicht am 04.06.2008
1. Gutachter Prof. Dr. A. Pfeifer
2. Gutachter Prof. Dr. M. Biel
Mündliche Prüfung am 14.07.2008
IDanksagung

Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei meiner Frau Zitlali bedanken, die mich während meiner
ganzen Promotion immer unterstützt und ermuntert hat. Sie hat mit viel Toleranz, Geduld und
Liebe meine vielen Wochenenden im Labor und am Computer ertragen. Darauf bin ich stolz
und möchte dies auch an dieser Stelle zum Ausdruck bringen. Ich danke meiner kleinen
Tochter Emilia Nayeli für das Dasein auf dieser Erde und jedes Lächeln, dass sie mir nach
einem anstrengendem Labortag schenkt.
Ein weiterer herzlicher Dank geht an meine Eltern und meinen Bruder Heiko, ohne deren
Unterstützung ich jetzt nicht das wäre, was ich heute bin. Ihr standet mir immer mit Rat und Tat
und familiärem Zusammenhalt zur Seite! Dabei gilt auch ein besonderer Dank meiner Omi, die
mich schon zu Schulzeiten auf den richtigen akademischen Weg gebracht hat. Meinen Onkels
Rolf und Bernd Klauer und ihren Familien, die mich während des Studiums in Heidelberg und
der Promotion in München tatkräftig unterstützt haben.

Ich danke Herrn Prof. Dr. Alexander Pfeifer, der meine Promotion betreut hat. Durch ihn habe
ich wissenschaftliches Arbeiten erst richtig erlernt und schätzen gelernt. Ich bedanke mich, für
anregende bis hin zu aufregenden und aufgeregten wissenschaftlichen Diskussionen, bei denen
trotz allen Ernstes der nötige Humor nie gefehlt hat. Herr Prof. Pfeifer war zu jeder Stunde für
alle Fragen und Probleme offen und hat mich stets intensiv und mit vollem Engagement
betreut.

Vielen Dank an Herrn Prof. Dr. Martin Biel für die Übernahme des zweiten Gutachtens und die
gute Zusammenarbeit mit seinem Labor während unserer Zeit in München.

Ebenso danke ich Prof. Dr. Reinhard Fässler für die vielen Hilfen, Ratschläge und
Labormaterialien, die uns sein Labor zur Verfügung gestellt hat, die maßgeblich zum
Fortschritt dieser Arbeit beigetragen haben.

Ganz besonders danke ich meinen Arbeitskollegen, vorne weg Dr. Andreas Hofmann, der mir
nicht nur im Arbeitsalltag immer mit Rat und Tat zur Seite stand, sondern mir auch privat bei
all zu oft „nur einem Bier“ ein guter Freund und Kumpel geworden ist. Meiner ehemaligen
Kollegin Katharina Hennecke für die lustige Zeit in München und die Aufbauhilfe zum
Laboreinstieg in Bonn. Daniela Scholz für das Einlernen in München, die tolle Zusammenarbeit
und vielen lustigen Abende jetzt auch in Bonn. Stefanie Kipschull für viele gelungene
II
Danksagung

Experiment und stetige Unterstützung. Ohne euch Zwei wäre es nur halb so lustig und
produktiv im Labor! Meiner treuen Kollegin Katja Jennissen, mit der ich Büro und Laboralltag
teile, für die gute Zusammenarbeit, das Korrekturlesen dieser Arbeit und hin und wieder ein
aufmunterndes Lächeln, dass sagt: „Alles wird gut, Bodo!“
Regina Müller danke ich für die Unterstützung im Labor. Ebenso danke ich Diana Messow,
Andrea Kabermann, Heidi Sebald, Beate Syttkus, Tiong Ti Lim, Maike Schulte, Jutta Mülich
und Christina Stichnote für die gute Zusammenarbeit.

Zu guter Letzt bedanke ich mich bei meine ehemaligen Münchner Kollegen, besonders Dr.
Christian Eckert, meinem Fernsehquiz-Partner und WG-Kollegen, Drs. Heidi Geiger und
Ludwig Baumann für die wunderbare Zeit in München, die mir immer in Erinnerung bleiben
wird. Christina Griesmeier, dem Prakti, Dr. Stylianos Michalakis und Prof. Dr. Christian Wahl
für tolle Zusammenarbeit und lustige Stunden.


BAT rules und alles wird gut!!!
III
Table of Contents

Erklärung...........................................................................................................................................I
Danksagung...................................................................................................................................... II
Table of Contents ...........................................................................................................................IV
Abbreviations................................................................................................................................ VII
1. Introduction1
1.1. The NO/cGMP signaling cascade ..................................................................................1
1.2. Structure, expression and function of PKGs..................................................................2
1.2.1. Physiological role of PKGI ...............................................................................4
1.2.2. Brown adipose tissue – BAT.............................................................................6
1.2.2.1. Insulin signaling in BAT8
1.2.3. Adipogenic differentiation - Mesenchymal stem cells......................................9
1.3. Aim of the PhD thesis ..................................................................................................11
2. Materials and Methods..............................................................................................12
2.1. Common chemicals......................................................................................................12
2.2. Animals........................................................................................................................
2.3. Histological analysis....................................................................................................12
2.3.1. Preparation of paraffin sections.......................................................................13
2.3.2. Hematoxylin/Eosin staining............................................................................13
2.4. Immunological methods...............................................................................................14
2.4.1. Materials immunological analysis...................................................................
2.4.2. Immunostaining of brown adipose tissue sections..........................................15
2.4.3. F-Actin staining of adherent cells in culture ...................................................16
2.4.4. Staining of mitochondria by MitoTracker fluorescence .................................17
2.4.5. Microscopy......................................................................................................18
2.4.5.1. Fluorescence microscopy
2.4.5.2. Electron microscopy....................................................................................18
2.5. Cell culture methods....................................................................................................19
2.5.1. Materials cell culture.......................................................................................19
2.5.2. Isolation and culture of primary BAT-derived mesenchymal stem cells........19
2.5.2.1. Immortalization of primary BAT-MSCs.....................................................20
2.5.3. Cell culture and trypsinization of cell lines21
2.5.3.1. Cryo-preservation of cells ...........................................................................21
2.5.3.2. Thawing of cryo-preserved cells.................................................................21
2.5.4. Adipogenic differentiation of immortalized brown adipocytes ......................22
2.5.4.1. Oil Red O staining of differentiated adipocytes..........................................22
2.5.4.2. Triglyceride determination of differentiated adipocytes.............................23
2.5.5. Osteogenic differentiation of immortalized brown adipocytes.......................24
2.5.5.1. Alkaline phosphatase staining of osteoblasts..............................................25
2.5.6. Luciferase reporter assays...............................................................................25
2.6. Biochemical Methods...................................................................................................26
2.6.1. Materials biochemistry....................................................................................
2.6.2. Preparation of total protein lysates from