DST HS Thèse déchets
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Etude du prélèvement, du stockage et de la dégradationdes hydrocarbures polycycliques aromatiques pardeux champignons telluriques : un champignon saprophyte, Fusarium solani, et un champignon endomycorhizien, Glomus intraradices.Anthony VERDINDirecteur de thèse le professeur Roger DURAND et le Dr Anissa Lounès Hadj-SahraouiAu sein du laboratoire de mycologie/phytopathologie/environnement de l’université du Littoral-Côte d’Opale à CalaisL’objectif de ce travail était de mieux comprendre les Ces résultats sont confirmés par une étude en microscopiemécanismes physiologiques et moléculaires mis en œuvre par électronique qui n’a révélé aucune structure spécifique induitedeux champignons telluriques pour dégrader les hydrocarbures chez F. solani en présence de benzo[a]pyrène (Publications polycycliques aromatiques en culture in vitro : le champignon n° 2 et 4).saprophyte Fusarium solani et le champignon endomycorhizien L’accumulation des HPA dans les lipides semble un phénomèneGlomus intraradices. commun à divers organismes (plantes : Kipopoulu et al., 1999 ;Simmonich et Hites, 1994 ; poissons : Baussant et al., 2001 ;La première partie de ce travail a porté sur le phénomène de bactéries : Bastiaens, 2000). Néanmoins, et à notre connaissance,prélèvement et de stockage des HPA chez F. solani. Nous avons c’est la première fois que cette accumulation et sa localisationdémontré, grâce à l’utilisation d’inhibiteurs du cytosquelette cytologique ont été mis en ...

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L’objectif de ce travail était de mieux comprendre les
mécanismes physiologiques et moléculaires mis en œuvre par
deux champignons telluriques pour dégrader les hydrocarbures
polycycliques aromatiques en culture in vitro : le champignon
saprophyte
Fusarium solani
et le champignon endomycorhizien
Glomus intraradices
.
La première partie de ce travail a porté sur le phénomène de
prélèvement et de stockage des HPA chez
F.solani
. Nous avons
démontré, grâce à l’utilisation d’inhibiteurs du cytosquelette
(colchicine et cytochalasine), d’un inhibiteur de la cytochrome
oxidase (l’azide de sodium) et par la mesure du phénomène
à basse température (4° C), que l’entrée du benzo[a]pyrène
à l’intérieur des hyphes de
F. solani
se fait par transport passif.
A ce jour, aucune étude sur le mode de transport des HPA par
les champignons n’a été rapportée.
D’autre part, nous avons pu, grâce à l’utilisation de colorants
spécifiques des lipides : le soudan III et la rhodamine B,
caractériser les structures intracellulaires de stockage des
hydrocarbures. Il s’agit de vésicules lipidiques préexistantes
dans les hyphes fongiques.
Figure 1 :
Ces résultats sont confirmés par une étude en microscopie
électronique qui n’a révélé aucune structure spécifique induite
chez
F. solani
en présence de benzo[a]pyrène (Publications
n° 2 et 4).
L’accumulation des HPA dans les lipides semble un phénomène
commun à divers organismes (plantes : Kipopoulu et al., 1999 ;
Simmonich et Hites, 1994 ; poissons : Baussant et al., 2001 ;
bactéries :Bastiaens,2000).Néanmoins,et à notre connaissance,
c’est la première fois que cette accumulation et sa localisation
cytologique ont été mis en évidence chez les champignons. Il
a également été montré que ce phénomène d’accumulation et
de stockage des HPA dans les vésicules lipidiques est observé
pour tous les HPA testés (l’anthracène, le pyrène, le
benzo[a]pyrène, le benzo[ghi]pérylène et le coronène), ainsi
qu’avec les polychlorobiphényls (PCB) (Résultats non montrés).
En outre, ce phénomène semble commun à l’ensemble des
souches fongiques, quelle que soit leur position taxonomique
et indépendamment des taux de dégradation qu’elles
présentent.
Etude du prélèvement, du stockage et de la dégradation
des hydrocarbures polycycliques aromatiques par
deux champignons telluriques : un champignon
saprophyte, Fusarium solani, et un champignon
endomycorhizien, Glomus intraradices.
Anthony VERDIN
Directeur de thèse le professeur Roger DURAND et le Dr Anissa Lounès Hadj-Sahraoui
Au sein du laboratoire de mycologie/phytopathologie/environnement de l’université du Littoral-Côte d’Opale à Calais
DÉCHETS - REVUE FRANCOPHONE D’ÉCOLOGIE INDUSTRIELLE - CAHIER SPÉCIAL DU NUMÉRO 44 - DÉCEMBRE 2006 - REPRODUCTION INTERDITE
Figure 1 : Observation des structures intracellulaires de stockage dans les hyphes
de
Fusarium solani
cultivé en milieu synthétique supplémenté de glucose (10 g/l)
en présence de benzo[a]pyrène (0,4mM) (Grossissement *1000 ;------------
= 5 mm).
(a) Lumière blanche; (b) Lumière blanche après coloration au Soudan III; (c)
fluorescence avec filtre DAPI; (d) fluorescence avec filtre FITC.
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Ce phénomène a également été observé dans les cellules
racinaires de plantes (Publication n° 7).
Ce phénomène d’accumulation serait donc commun à tous les
composés hydrophobes, ce qui soulève le problème de la
consommation d’aliments contaminés (poissons, fruits de mer,
légumes… lorsque ceux-ci se trouvent dans des zones
contaminées) et de la bioaccumulation au sein de la chaîne
alimentaire pour des composés aussi nocifs.
Nous avons ensuite procédé à une analyse comparative,
qualitative et quantitative, des stérols et acides gras totaux de
F. solani
cultivé en présence de benzo[a]pyrène. La présence de
benzo[a]pyrène dans le milieu de culture semble perturber la
synthèse lipidique au niveau quantitatif (baisse du contenu en
acides gras de 17 % et des stérols de 30 %). Il est important
de noter une baisse de 33 % de la quantité d’ergostérol dans
les cultures contenant du benzo[a]pyrène. Cependant aucune
différence qualitative des stérols et acides gras totaux n’a été
détectée (Publications n° 6).
Le second aspect du travail a été l’étude des mécanismes
enzymatiques mis en jeu par
F. solan
i dans la dégradation des
HPA. D’après la littérature, les champignons métaboliseraient
les hydrocarbures grâce à deux voies d’oxydation. La première
voie mettrait en jeu des enzymes non spécifiques impliquées
dans la dégradation de la lignine, et la seconde mettrait en jeu,
comme chez les mammifères, des monooxygènases à
cytochrome P450 (Cerniglia, 1993).
Comme il a été suggéré par certains auteurs, les champignons
non ligninolytiques pourraient oxyder les HPA à l’aide d’enzymes
ligninolytiques (Müncnerova et Augustin, 1994 ; Casillas et al.,
1996 ; Pothuluri et al., 1996), nous avons recherché chez
F.solani
la présence de lignine-oxydases non spécifiques (de type
laccase,lignine peroxydase,manganèse-dépendante peroxydase)
qui pourraient intervenir dans la dégradation des HPA. Des
activités enzymatiques extracellulaires de type laccase ont été
détectées chez
F. solani
, mais aucune corrélation entre ces
activités enzymatiques et la dégradation des HPA n’a pu être
établie. En effet, comparées aux activités mesurées dans les
cultures témoins, les activités enzymatiques étaient identiques
voire sensiblement inférieures lorsque le champignon est cultivé
en présence de benzo[a]pyrène.De plus,l’inhibition de l’activité
laccase par l’utilisation de l’azide de sodium n’a pas eu d’influence
sur le taux de dégradation. Nous pouvons donc en conclure
que chez
F. solani
, les activités enzymatiques extracellulaires de
type lignine-oxydases ne semblent pas intervenir dans la
dégradation du benzo[a]pyrène, ou en tout cas ne sont pas les
enzymes clefs du métabolisme de cet HPA. En outre, des tests
menés chez deux autres souches,
Trichoderma viride
et
Fusarium
oxysporum
, respectivement meilleur et moins bon dégradeur
du benzo[a]pyrène que
F. solani
ont confirmé cette conclusion.
En effet, aucune activité lignine oxydases n’a été détectée chez
T. viride
alors qu’une activité laccase plus importante que celle
observée chez
F. solani
a été détectée chez
F. oxysporum
(Publication n°1).
Ces résultats semblent confirmer les précédents travaux réalisés
sur
F. solani
, et nous ont orienté vers la voie des enzymes de
type monooxygénases à cytochrome P450. En effet,
l’intervention des enzymes intracellulaires de type
monooxygénases à Cytochrome P450 avaient été suspectées
par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques (Rafin et al.,2000).Chez
les mammifères, les enzymes à cytochrome P450 sont
responsables d’une grande variété de biotransformations, soit
dans le métabolisme primaire soit dans les réactions de
détoxification (Danielson, 2002). Ces enzymes requièrent pour
fonctionner un second système enzymatique donneur
d’électrons : la cytochrome P450 réductase (CPR).Après avoir
démontré la présence de cytochrome P450 (par dosage
spectral), nous avons mis en évidence une induction de la CPR
lorsque
F. solani
est cultivé en présence de benzo[a]pyrène. En
effet, l’activité de cette enzyme est plus de trois fois supérieure
en présence de benzo[a]pyrène, ce qui suggère, de façon
indirecte, une activité accrue des cytochromes P450.
Afin d’approfondir ces résultats, des dosages d’enzymes
intracellulaires,connues pour être impliqués dans le métabolisme
des HPA, ont été menés (EROD, GST…) (Publications n° 8).
En plus de la position membranaire et de la faible expression
des cytochromes P450, leur multiplicité les rend difficile à
mettre en évidence par des méthodes biochimiques.Ainsi, peu
de protocoles de dosage d’activité à cytochrome P450 sont
disponibles.Chez les mammifères,le dosage de l’activité EROD
(éthoxyrésorufin-O-dééthylase) correspondant à l’activité de
la famille de cytochromes P450 1A1 a été développé, et cette
famille de cytochromes a été démontrée comme étant
primordiale dans la détoxification des xénobiotiques. Nous
avons donc recherché cette enzyme chez
F. solani
. Aucune
activité enzymatique à cytochromes P450 1A1 n’a pu être
détectée chez
F. solani
. Ces résultats négatifs semblent indiquer
que l’EROD n’est pas impliquée dans la dégradation des HPA
chez
F. solani
, une autre famille de cytochromes étant
probablement impliquée (Publication n° 8).
CPR et enzymes à cytochrome P450 sont des enzymes
membranaires du réticulum endoplasmique, ce qui rend leur
caractérisation biochimique difficile. Les techniques protéiques
et/ou moléculaires apparaissent donc comme primordiales.
Une synthèse et/ou une induction de protéines potentiellement
impliquées dans la dégradation du benzo[a]pyrène a donc été
examinée chez
F.solani
en réalisant des électrophorèses mono-
(Publication n° 5) et bi-dimensionnelles (Publication n° 8)
comparatives.
Figure 2 :
Figure 2 :Observation,après migration électrophorétique à deux dimension
et coloration au nitrate d’argent, des protéines induites chez Fusarium
solani par la présence de benzo[a]pyrène (B) dans le milieu de culture.
(A = croissance en absence de benzo[a]pyrène).
DÉCHETS - REVUE FRANCOPHONE D’ÉCOLOGIE INDUSTRIELLE - CAHIER SPÉCIAL DU NUMÉRO 44 - DÉCEMBRE 2006 - REPRODUCTION INTERDITE
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DÉCHETS - REVUE FRANCOPHONE D’ÉCOLOGIE INDUSTRIELLE - CAHIER SPÉCIAL DU NUMÉRO 44 - DÉCEMBRE 2006 - REPRODUCTION INTERDITE
Ainsi, des polypeptides spécifiques observés après croissance
en présence de benzo[a]pyrène ont été mis en évidence. Ils
pourraient jouer divers rôles dans la dégradation des HPA :
enzymes des voies de dégradation, protéines de stress,
transporteurs.
Après séquençage, nous avons observé que deux de ces
polypeptides présentent une forte homologie avec une
porphobilinogène désaminase, enzyme-clef dans la synthèse
des groupements uroporphyrinogènes, éléments structuraux
des cytochromes P450. Cette induction d’une enzyme de
synthèse d’un précurseur des cytochromes P450 suggère une
nouvelle fois l’induction de cette enzyme et son intervention
dans la dégradation des HPA par
F. solani
.
Nous avons enfin étudié l’impact de deux HPA, l’un de faible
poids moléculaire (l’anthracène) et l’autre de haut poids
moléculaire (le benzo[a]pyrène), sur le développement de
racines de chicorée ou de carottes transformées par
Agrobacterium rhizogenes
et colonisées par
Glomus intraradices
.
Nous avons donc évalué l’impact de différentes concentrations
d’HPA sur la colonisation racinaire par un champignon EA,
ainsi que leur incidence sur la survie et la croissance des racines
se développant dans les milieux contaminés par les HPA. De
même, le rôle du champignon EVA sur la dégradation des HPA
a été étudié.
Les résultats présentés dans ce chapitre démontrent clairement
que le champignon mycorhizien
Glomus intraradices
est capable
d’accomplir l’intégralité de son cycle de développement
(germination, colonisation, sporulation) en présence des deux
HPA testés. La présence de polluant dans le milieu de culture
diminue cependant fortement la germination (inhibition
moyenne de 25 %), la colonisation (de 2 à 8 fois inférieure en
présence de polluant), la sporulation (de 10 à 100 fois moins
de spores en fonction de la concentration de polluant utilisée)
ainsi que la croissance racinaire (jusqu'à trois fois moins de
biomasse). Cependant, la colonisation racinaire par le
champignon EVA, même si elle est fortement affectée
négativement, se produit néanmoins en présence d’anthracène
et de benzo[a]pyrène et augmente significativement la croissance
racinaire (de 20 à 250 %) et la disparition du polluant (de 25
à 40 %). L’intérêt des champignons mycorhiziens dans la
dépollution des sols contaminés par les HPA a déjà été suggéré
ou démontré par des études in situ (Cunningham et al., 1996 ;
Günther et al., 1996) et des études « en pots » (Binet et al.,
2000 ; Joner et Leyval, 2001). Cependant, c’est la première fois
que des études in vitro rapportent le rôle d’un champignon
mycorhizien dans la dégradation des HPA.
La dégradation des HPA pourrait être le résultat d’une activité
peroxydase (de 2 à 4 fois plus importante dans les racines
mycorhizées par rapport aux racines témoins).
Ce résultat obtenu in vitro confirme les résultats obtenus in vivo
par Binet (1999), qui avait démontré la présence d’une activité
peroxydase dans les compartiments fongique et végétal de
cultures « en pots ». L’identification de métabolites issus d’une
activité peroxydase (de type quinone) représenterait alors une
preuve formelle de l’intervention de cette enzyme. Par cette
étude, nous avons confirmé, sur un matériel végétal et un autre
matériel fongique,le phénomène d’accumulation des HPA dans
les vésicules lipidiques, à la fois dans les cellules racinaires, les
hyphes, les vésicules ou les spores du champignon EVA. Ce
phénomène se produit dans les racines,qu’elles soient colonisées
ou non (Publication n° 7).
Il serait alors intéressant de déterminer si les vésicules observées
dans les structures fongiques sont propres aux capacités de
prélèvement du champignon lui-même,ou s’il s’agit d’un transfert
de la plante vers le champignon. Pour cela, une étude sera
menée en boîtes bicompartimentées. Nous pourrons en
déduire si le champignon accumule les HPA et si ceux-ci sont
transférés aux racines cultivées sur milieu sans HPA.