Real Time PCR Tutorial

William Hunt

Description

REAL TIME PCR Dr Margaret Hunt To see larger images, click on the image which will be enlarged in a pop-up window. You must close this window before opening PowerPoint version of this another. This does not yet apply to the first twelve images. These appear on a new page page FEEDBACK REAL TIME PCR Please use this address Polymerase chain reaction (PCR) is a method that allows exponential amplification of short DNA sequences (usually 100 to 600 bases) within a longer double stranded DNA molecule. PCR entails the use of a pair of USEFUL LINKS primers, each about 20 nucleotides in length, that are complementary to a defined sequence on each of the Real Time PCR Research two strands of the DNA. These primers are extended by a DNA polymerase so that a copy is made of the Real time PCR at Wikipediadesignated sequence. After making this copy, the same primers can be used again, not only to make another copy of the input DNA strand but also of the short copy made in the first round of synthesis. This leads to logarithmic amplification. Since it is necessary to raise the temperature to separate the two strands of the double strand DNA in each round of the amplification process, a major step forward was the discovery of a thermo-stable DNA polymerase (Taq polymerase) that was isolated from Thermus aquaticus, a bacterium that grows in hot pools; as a result it is not necessary to add new polymerase in every round of amplification. After several ...

Informations

• Publié par: Mizir
• Nombre de lectures: 229
• Langue: English

Extrait

SKNIL LU iT laeR  EFUS    t mieRla Rta eCP CR Rme Prch esea  ohegirit ac tofA ai rtsb kiW depi chain reymerase  apep P r lo an lCP R altha todthmea  si )RCP( noitcaon ocatilifi ampitlanonee pxolsw 60o t00s)seba0  nihtiw regnol a ort f shsequDNA  s u( neec yl1 usla eCRaint tls uheo es a friap fo  double strandedD ANm locelu.eP  ht ,htgnel ni seenemplom cre aat hbae care,srpmiotiducle20 nout  wt  e ts o o hcht f he tNA Dndraofs   aedifenatyrt  oce on ead sequen httas  opo ya c A poa DNraselymeetxe era ybdedne esTh. s erimpr t ih socyp ,ht ece. After makinggiseetanes dneuq  mise ad tof  d he y of copther   ano amekt  onoylon t, inga aeduse  bnac sremirp emas  the fir mad inro tocyp fht ehsalt  osoantrbud D tus ANeht pni  nece is  itSincest r ia yotssra treturapeem thet eht etarapes o  of syntst roundih s elda ehis.sT  itarichmtos og litac .nopma ifil nop acitss ,orecjor a ma forstepsaw drawsid eht   o ryveco ertha f  ows rtnasd o    fhte double strand  ANDe ni hcanuorofd he tmp afili  muiretcab  a ,suicatqu ausrmhe T  aera  slo;s topn hows i grothat aT( op qemylesrDNe poA -smobltaet drfmosai osal) that wlymerase ser teAf(ol raveifilpma    .noitacs ofoundlifi ampa obtfne)0r tu4  esecrysao  td adtlus ti n sin ton every round ofen wopylemaresi  umdiro bn  ahiet .ni roFedimats ough to ndant enet diwtebd teceosarag n  aond ze uba si dna leg e PCR the on, catianylsia cu trpdo am nc ynsesaht ,ame ntouf  o odpr tab se tesimq-auntitative and, iiht ,woldohtem salanf  os  iisys no sersawlihtta  out l be d beline sbneeco cn eroa  he  prese ecting trof ted  evilootalquatitPCf a R epo  sytt ihikgnA mat DNinpu of tnuoma eht ot deatel rot nist uc e to convert mRNsr ertnacsirtpsadeenusd g invere em edohtsaw  txe  A (mr RN, thRNA)ru eemsaneegemss oIn. NAo  terrdtrap a fD raluci sed to m s been  u teoh dah shtsim  tiarlacuofs  p al ehleveusaet ertionondint cfered fidnreANu  rRmve elyaltuacs  idohtem eht tub s atyrD AN( DcAN )A into complemen ilpmdeif yb  RCP ichwah ths   a en yba ez desg agor agaand,nalyin am nI .siesac ynactle eelesorphro fer erreo sinetfT-"RR"PCtod s  a snuoftrw ihhci  it can unate ashtiw desufnoc eb R"PCe-im   t alre "  .  le n   qssntuaatit evinahtRCP  fo DNA because of tehe txarr vereescrnsra t ssetaipveR .petart esreiptanscr CR a se- Pis sanylNR Afom 

As we shalle se below, one reason that maker s  er etrvaenscriptase-PCR, as usually practiced, non- quantitative   tishat ethidiu bmromide is a rather insensitive  Msteatihno.ds such as competitive PCR were  developed to make the method more quanti t ahteivy ea rbeu tv ery cumbersome and time-consuming to  perform. Thus, real-timeR  (PoCr reversea tnrscriptase real-time PCR) was developed. 

 

PowerPoint version of this To see larer imaecs,k  colin teh imae which will be enlairn ae d o-u window. You mu s et  tchl ios windowefbore o enin pag   e another. This does not yet taop tphlye  first twelve images. These appear on a    new page

    

REAL TIME PCR Dr Margaret H   unt

Pleas F e E  u E s D t e hi B s A a C d K d   ress REAL TIME P    CR

 

  

 

 

 

   First, let us review revterrasnes criptase PCR in more detail  Polymeraseh cain reaction (PCR) allows the expocnoepnyt i nalg  of part of a DNA molecule  using a DNA  polymerase enzyme that isa tnotl teor elevated temperatures.  

1. mRNA is copied to cDNA by reverse tran sucsriinpgt aasne oligo dT primer (random eorlsi gmoamy also  be used). In real-time  PwCeR ,usually use a revet r asne scriptase that has an endo H activity. This removes  the mRNA allowing theo snde cstrand of DNA to brme efod. A PCR mix is then set up wlhuicdhe si nac heat- stable polymerase (such as Taq polymerase)p, rismp e crisf ifco r the gene of interest, deoxynucleotides and  a suitable buffer. 2. cDNA is denatured at mhoarne  9t0 degrees (~94 degrees) so tthwato   tshter ands separate. The sample  is cooled to 50 to 60 degrees and specifica rperi manernse aled that are comepnlteamry to a site on each  strand. The primers sites may be 0u0p  tboa s6e sapart but are often about 100 bases sappeacrita,l ley  when real-time PCR is used.

3. The temperature is raised to 72 degrees an-ds t haeb leh eT a tq DNA polymerase extends the DNA from   the primers. Now we have fDoNurA  cstrands (from the oritgwinoa).l   These are denatured again at approximat el9y4 degrees.  

4. Again, the primers are aendn eaat la suitable tempera(tsuorem ewhere between 50 and 60 degrees) 

5. Taq DNA polymerase binds and extends friomme rt htoe  tphre end of thDeN cA strand. There are now  eight cDNA rsatnds    

6. Again, the strands are d e nda tbuyr raising the temperatu9r4e  tdoe grees and then the primers are  annealed at 60 degrees