Silencing of endoglin in rat hepatic stellate cells by RNA interference identifies endoglin as an important component of the transdifferentiation process [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Wanda Nicolette Vreden

Sujets

• Gesundheit

Informations

• Publié par: rheinisch-westfalischen_technischen_hochschule_-rwth-_aachen
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 33
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

Silencing of endoglin in rat hepatic stellate cells
by RNA interference
identifies endoglin as an important component of the transdifferentiation process
Von der Fakultat¨ fur¨ Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH
Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der
Naturwissenschaften genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Diplom Biochemikerin
Wanda Nicolette Vreden
aus Duisburg
Berichter: Privatdozent Dr. rer. nat Christoph Peterhansel¨
Universitatspr¨ ofessor Dr. rer. nat Ralf Weiskirchen
Tag der mundlichen¨ Prufung:¨ 24.06.2008
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfugbar¨ .Die vorliegende Doktorarbeit wurde in der Zeit vom 15. Februar 2005 bis zum 4. April
2008 im Institut fur¨ Klinische Chemie und Pathobiochemie angefertigt und ist in englis
cher Sprache verfasst.
Referent:
PD. Dr. rer. nat. C. Peterhansel¨
Institute for Biology I
Rheinisch Westfalische¨ Hochschule Aachen (Germany)
Co Referent:
Prof. Dr. rer. nat. R. Weiskirchen
Institute of Clinical Chemistry and Pathobiochemistry
University Hospital Aachen (Germany)
Co Referent:
Prof. Dr. rer. nat. F.M. Kreuzaler
Institute for Biology I
Rheinisch Westfalische¨ Hochschule Aachen (Germany)Fur¨ meine Lieben!Contents
1 Introduction 1
1.1 Signal transduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.1 General principles of signal transduction . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.2 The TGF b pathway . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Endoglin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2.1 Structure of endoglin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2.2 Function of . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3 The Liver . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.3.1 Function and anatomy of the liver . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.3.2 of HSC during liver fibrogenesis . . . . . . . . . . . . . 10
1.4 RNAi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.4.1 RNAi as an experimental tool for sequence specific gene silencing 14
2 Materials and methods 18
2.1 Plastic ware . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.3 Chemicals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.4 Radioactive materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.5 Enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.6 Molecular size standards . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.7 Cytokines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.8 Multicomponent systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.9 Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.9.1 First antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.9.2 Secondary antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
iContents
2.10 Microorganisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.10.1 Adenoviruses used in this study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.10.2 E. coli strains used in this study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.10.3 Eucaryotic cells used in this study . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.11 Oligonucleotides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.12 for gene silencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.13 Plasmids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.14 Solutions and buffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.15 Media for cell culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.16 Analytical methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.16.1 Calculation of DNA concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.16.2 of RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.16.3 Calculation of adenoviral stock concentration . . . . . . . . . . . 38
2.16.4 of protein concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.17 Cell culture methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.17.1 Culture conditions of E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.17.2 Culture of COS 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.17.3 Coverglass preparation for microscopy . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.17.4 Isolation of rat hepatic stellate cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.17.5 Culture conditions of rat hepatic stellate cells . . . . . . . . . . . . . 40
2.17.6 Stimulation of rat hepatic stellate cells . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.18 Biochemical methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.18.1 Preparation of total protein lysate from rat hepatic stellate cells . . 41
2.18.2 SDS polyacrylamide gel electrophoresis . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.18.3 Western blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.18.4 Luciferase assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.18.5 Proliferation assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.18.6 Gelatinase assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.19 Molecular biological methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.19.1 Isolation of plasmid DNA (Miniprep) . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.19.2 of RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.19.3 Formaldehyde agarose gel electrophoresis . . . . . . . . . . . . . 43
2.19.4 Northern blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.19.5 cDNA synthesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
iiContents
2.19.6 Polymerase chain reaction (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.19.7 DNA sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.19.8 Cloning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.19.9 Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.19.10 Transfection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.19.11 Infection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.20 Adenoviruses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.20.1 Generation of the shRNA expression vector . . . . . . . . . . . . . 50
2.20.2 of the (BRE) and (CAGA) MLP luciferase shuttle2 12
vectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.20.3 Production and amplification of adenoviral stocks . . . . . . . . . 51
2.20.4 Purification of adenoviral stocks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.20.5 CRP2 adenovirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.21 Whole rat genome oligo microarray . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.21.1 Sample preparation and quality check . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.21.2 Hybridization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.21.3 Data analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.22 Microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.22.1 Bright field microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.22.2 Immunofluorescence microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3 Results 56
3.1 RNAi - Inhibition of endoglin expression in HSC . . . . . . . . . . . . . . 57
3.1.1 shRNA virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
3.1.2 siRNA oligonucleotides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
3.1.3 Knock down of endoglin in HSC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
3.2 Characterization of endoglin deficient HSC . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.2.1 Morphology and ECM abundance . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.2.2 Cytoskeleton organization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.2.3 Migration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.2.4 Proliferation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.2.5 Whole genome microarray . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.2.6 Summary: Characterization of endoglin deficient HSC . . . . . . 81
3.3 a Macroglobulin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 822
iiiContents
3.3.1 a Macroglobulin down regulation through endoglin silencing . 822
3.3.2 Gelatinase and collagenase assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.3.3 siRNA targeting a macroglobulin . . . . . . . . . . . . . . . . . . 862
3.4 Stimulation Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
3.4.1 TGF b1 and BMP 7 stimulation experiments . . . . . . . . . . . . 88
4 Discussion 92
4.1 Down regulation of endoglin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
4.2 The impact of endoglin down regulation on HSC transdifferentiation . . 95
4.3 The role of endoglin in the TGF b1 and BMP 7 pathways . . . . . . . . . 100
5 Conclusions 103
Appendix
A Selected