Solid-state NMR investigations of the ATP binding cassette multidrug transporter LmrA [Elektronische Ressource] / von Alena Siarheyeva

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• Publié par: goethe_universitat_frankfurt_am_main
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 57
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

Solid-State NMR Investigations of the ATP Binding
Cassette Multidrug Transporter LmrA





Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften



vorgelegt dem Fachbereich Biochemie, Chemie, Pharmazie
Institut für Biophysikalische Chemie
Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main
Zentrum für Biomolekulare Magnetische Resonanz




von
Alena Siarheyeva
aus Minsk
Frankfurt am Main 2006













vom Fachbereich: Biochemie, Chemie, Pharmazie....................................................................
Johann Wolfgang Goethe – Universität als Dissertation angenommen





Dekan: Prof. Dr. Schwalbe
Gutachter:

Datum der Disputation
2Fachbereich 14
der Johann Wolfgang Goethe- Universität
Der Bewerber................
hat heute das Promotionsverfahren im Fach................

mit der Gesamtnote..................
abgeschlossen.
Die einzelnen Prüfungsleistungen wurden wie folgt bewertet:
Dissertation:..................
Disputation:....................
Das Recht zur Führung des Doktortitels wird nicht durch diese Bescheinigung, sondern erst durch die
Aushändigung der Urkunde erworben.
Frankfurt am Main, den

(Siegel)


Der Dekan
(Unterschrift)
3

(Siegel der UIniversität)
Der Fachbereich 14
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
verleiht
Alena Siarheyeva
aus Minsk
den Grad eines Doktors der Naturwissenschaften
nachdem sie in ordnungsgemä βem Promotionsverfahren
durch die Arbeit
Solid-state NMR investigations of the ATP binding cassette multidrug transporter LmrA
und eine öffentliche Disputation ihre wissenschaftliche Befähigung erwiesen hat. Die
Promotionsleistung wurde mit

(Gesamtnote) beurteilt.
Frankfurt am Main, den


Der Dekan
(Unterschrift)

4
Summary

The development of resistance to multiple drugs is a major problem in treatment of number of
infectious diseases and cancer. The phenomenon of multidrug resistance (MDR) is based on the
synergetic interplay of a number of mechanisms such as target inactivation, target alteration,
prevention of drug influx as well as active extrusion of drugs from the cell. The latter is mediated by
over-expression of multidrug efflux pumps. The first discovered and the best characterized until now
the human MDR transporter is P-glycoprotein. It is a member of the ATP binding cassette (ABC)
superfamily and acts as an active transporter for a variety of anticancer agents using the energy
released by ATP hydrolysis. The closest structure and functional homologue of P-glycoprotein found
in bacteria is LmrA from Lactococcus lactis.
The major goals of this work are to establish the selective isotope labelling of LmrA in Lactococcus
lactis, to optimize LmrA sample preparation for solid-state NMR, and finally to perform first solid-
state NMR investigations on LmrA shedding light on its catalytic cycle and substrate binding. For a
long time the solid-state NMR applications to biological science has been limited to investigation of
small molecules mostly. Recently, the solid-state NMR methods have shown potential for structural-
and non-perturbing, site directed functional studies of large membrane proteins as well as ligands
bound to them. However, to our knowledge neither selective isotope amino acid labelling of any ABC
transporter, nor NMR investigations on full-length ABC transporter have been reported to date. Solid-
state NMR experiments on a membrane protein require reconstitution of purified proteins into a
membrane environment at a high density and either isotopic enrichment of the protein or bound drugs
or inhibitors. Therefore, the large quantities of LmrA reconstituted at a high density in lipid
membranes, sufficient for advanced NMR studies have been produced and its functional state in
reconstituted form has been assessed. In the next step, a procedure for cost effective selective amino
acids isotope labelling of LmrA in Lactococcus lactis has been established.
Using this protocol deuterium alanine labelled LmrA reconstituted into E. coli liposomes has been
prepared. Deuterium NMR has been used extensively to assess the proteins dynamics in past.
52However, it has never been applied to ABC transporter. Here, we report H NMR on selective alanine
isotope labelled LmrA which has been used to shed light on the dynamics changes in the protein
occurred under AMP-PNP, non-hydrolysable ATP analogue, binding and in ATP/ADP-Vanadate
trapped state. It has been found that the major conformation changes affecting the protein motional
characteristics occur in the ATP binding domains but not in the transmembrane domains.
Additionally, the binding of several substrates to LmrA has been studied by fluorescence
19 31spectroscopy as well as by F and P solid-state NMR. The binding constants for several LmrA
substrates have been obtained by fitting the concentration dependant tryptophan intrinsic fluorescence
quenching curves. Based on the fluorescence studies and solid-state NMR data, the conformation
changes in LmrA under substrate binding have been discussed.
In addition, the preferable location of nine LmrA and P-glycoprotein substrates within the model
1membrane has been studied via H-MAS-NOESY-NMR. The results have been interpreted with
respect to LmrA and P-glycoprotein binding site accessibility from the membrane interface region.
6
Zusammenfassung

Die Entstehung von Resistenzen gegenüber mehrerer Wirkstoffe ist ein großes Problem bei der
Behandlung einiger ansteckender Krankheiten und Krebs.
Multiwirkstoff Resistenzen (MDR) basieren auf einem synergetischen Zusammenspiel mehrerer
Mechanismen wie der Inaktivierung oder Veränderung des Angriffziels, Verhinderung des
Wirkstoffeinstroms ebenso wie der aktive Transport von Wirkstoffen aus der Zelle heraus.
Der letzere wird durch die Überexpression von Multidrug Effluxpumpe vermittelt. Der erst entdeckte
und am besten charakterisierte ist der menschliche MDR Transporter P-Glycoprotein.
Er gehört zur Superfamilie der ATP Bindekassetten (ABC) und wirkt als aktiver Transporter für
mehrere Anti-Krebs Stoffe. Die Energie wird durch ATP Hydrolyse gewonnen. Die ähnlichste
Struktur und funktionelles Homolog von P-Glykoprotein, das in Bakterien gefunden wurde, ist LmrA
von Lactococcus lactis.
Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, LmrA in Lactococcus lactis aminosäureselektiv mit Isotopen zu
markieren, die Probenpräperation für Festkörper NMR zu optimieren und letztendlich erste Festkörper
NMR Untersuchungen an LmrA durchzuführen, um den katalytischen Zyklus und die Substrat-
Bindung aufzuklären.
Seit längerer Zeit waren die Anwendungen der Festkörper NMR im Bereich der Biologie meist auf die
Untersuchung kleiner Moleküle beschränkt. Kürzlich haben die Methoden der Festkörper NMR
Potential für strukturelle und nicht-störende ortsspezifische funktionale Studien großer
Membranproteine sowie ihrer Liganden gezeigt. Es gibt bis jetzt jedoch nach unserem Wissen weder
amonosäureselektive Isotopen-Markierung von ABC Transportern, noch NMR Untersuchungen an
einem gesamten ABC Transporter. Festkörper NMR Experimente an einem Membranprotein erfordern
die Rekonstitution mit einer hohen Konzentration und entweder Anreicherung von Isotopen des
Proteins oder gebundener Wirkstoffe oder Inhibitoren. Deshalb wurden große Mengen von LmrA mit
einer hohen Konzentration in Lipidmembranen für Festkörper-NMR rekonstituiert. Im nächsten
Schritt wurde ein Verfahren für effiziente selektive Markierung von Aminosäuren von LmrA in
7Lactococcus lactis etabliert.
Unter Verwendung dieses Protokolles wurde LmrA, das mit deuteriertem Alanin markiert war und in
E. coli Liposomen rekonstituiert war, hergestellt.
Deuterium NMR wurde in der Vergangenheit umfangreich genutzt um die Dynamik der Proteine zu
2untersuchen. Sie wurde jedoch niemals auf ABC Transporter angewendet. Hier werden H NMR
experimente an Alanin-Isotopen markiertem LmrA vorgestellt, um die Veränderungen der Dynamik in
dem Protein bei Bindung von AMP-PNP, einem nicht hydrolysierbares ATP Analogon, und in einem
im ATP/ ADP-Vandat eingefangenen Zustand zu zeigen. Es stellte sich heraus, dass die wichtigsten
Konformationsänderungen, die die Bewegung des Proteins beeinflussen, in der ATP-Binde-Domäne
auftreten, nicht aber in den Transmembran-Domänen.
Zusätzlich wurde die Bindung mehrerer Substrate an LmrA mit Fluoreszenz Spektroskopie untersucht
19 31als auch mit F und P Festkörper NMR. Die Bindungs-Konstanten für mehrere LmrA Substrate
wurden mittels Tryptophan Fluoreszenz–Quenching erhalten. Bezogen auf die Fluoreszenz-
Untersuchungen und Festkörper NMR Daten wurden die Konformations-Änderungen von LmrA bei
der Substrat Bindung diskutiert.
Zusatzlich wurde die