Somatic embryogenesis and transformation studies in Schlumbergera and Rhipsalidopsis [Elektronische Ressource] / von Ezz Al-Dein Muhammed al-Ramamneh

Ezz Al-Dein Muhammed Al-Ramamneh

Informations

• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 31
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 1 Mo

Extrait

Somatic Embryogenesis and Transformation

Studies in Schlumbergera and Rhipsalidopsis






Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Universität Hannover
zur Erlangung
des akademischen Grades eines


Doktors der Gartenbauwissenschaften
-Dr. rer. hort.-




genehmigte
Dissertation



von
Ezz AL-Dein Muhammed Al-Ramamneh, M. Sc. Hort. (Jordan)
geboren am 14. January 1973 in Sweileh, Jordan

2006




























Referentin: Prof. Dr. Margrethe Serek
Korreferentin: Prof. Dr. Sridevy Sriskandarajah
Tag der Promotion: 12. Januar 2006
Zusammenfassung

Ezz AL-Dein AL-Ramamneh

Somatische Embryogenese und Untersuchungen zur Transformation
bei Schlumbergera und Rhipsalidopsis

Schlagwörter: Genetische Transformation - Osterkaktus - Transgen -
Weihnachtskaktus

Die In-vitro-Kultur bietet für Kakteen Möglichkeiten zur Vermehrung, somatischen
Embryogenese und genetischen Transformation. In der vorliegenden Arbeit wurde
somatische Embryogenese an Phyllokladien-Explantaten von Schlumbergera truncata
cv. Russian Dancer induziert. Kallus, der sich an Phyllokladien-Explantaten gebildet
hatte, wurde über einen Zeitraum von 16 Monaten auf MS-Medium mit Cytokininen
kultiviert. Im Hinblick auf die Induktion somatischer Embryonen war diese
Behandlung einer kürzeren Etablierungsphase überlegen. Somatische Embryonen
differenzierten nach drei bis fünf Monaten, wenn Kallus, der in flüssigem Medium auf
SH- oder MS-Basis mit 7 µM Kinetin kultiviert worden war, auf festes MS-Medium
entweder mit 0,45 µM 2,4-D oder hormonfrei überführt wurde. Die
Medienzusammensetzung, Wachstumsregulatoren sowie die Dauer der Kultur auf
cytokininhaltigen Medien hatten einen Einfluss auf die Embryogenese. Die höchste
durchschnittliche Anzahl von Embryonen in unterschiedlichen Stadien wurde erzielt,
wenn die erste Kulturphase von 30 Tagen in flüssigem SH-Medium, und die zweite
auf hormonfreiem MS-Medium erfolgte. Ungefähr 70 % der somatischen Embryonen
keimten auf G-Medium. Anschließend wurden die auf somatische Embryonen
zurückgehenden Pflanzen erfolgreich in Erde überführt. Sie zeigten genetische
Stabilität im Vergleich zu den Ausgangspflanzen mit Ausnahme der Pflanzen, die sich
aus somatischen Embryonen mit mehr als vier Keimblättern entwickelt hatten.
Zusätzlich wurde ein sehr effizientes Regenerationssystem über
Adventivsprossbildung für Schlumbergera cv. Alex und Rhipsalidopsis cv. CB5
entwickelt. Darüber hinaus wurden diese effizienten Regenerationssysteme
weiterentwickelt und erfolgreich eingesetzt, um erstmals transgene Pflanzen von
Rhipsalidopsis cv. CB5 zu erzeugen, die das uidA-Gen und das selektierbare
Markergen nptII enthielten. Einige Faktoren, die die Transformation von sis-Kallus beeinflussen, wurden untersucht. Transformierte
Rhipsalidopsis-Kallusse wurden nach längerer Kultur auf Medien mit 600 mg/l
Kanamycin erhalten. Eine Vor-Inkubation von Agrobacterium tumefaciens in SIM-
Medium mit Acetosyringon steigerte die Häufigkeit, mit der transgene Kallusse
erzielt wurden. Desweiteren war ein zusätzlicher Waschschritt der Kallus-Explantate
mit Cefotaxim nach der Ko-Kultur notwendig, um Agrobacterium tumefaciens zu
unterdrücken. Der Verzicht auf Kanamycin im Medium für den letzten Kulturschritt
sowie die Kultur der transformierten Kallusse unter Ernährungsstress führte zur
Bildung transgener Adventivsprosse. Mit diesem Ansatz wurde eine
Transformationsrate von 22,7 % erreicht. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse
zeigen, dass der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer ein vielversprechender
Ansatz für die Erzeugung neuer Genotypen bei diesen beiden Kakteenarten ist.

i
Abstract

Ezz AL-Dein AL-Ramamneh

Somatic Embryogenesis and Transformation
Studies in Schlumbergera and Rhipsalidopsis

Keywords: Christmas cactus - Easter cactus - genetic transformation - transgene

Tissue culture has emerged as a tool for cacti micropropagation, somatic
embryogenesis and genetic manipulation. Somatic embryogenesis was induced from
phylloclade explants of Schlumbergera truncata cv. Russian Dancer. Callus that
developed on phylloclade explants and sub-cultured over a period of 16 months on
MS medium containing cytokinins was superior for the induction of somatic embryos
compared to callus grown for a shorter time in the establishment phase. Somatic
embryos were induced after three to five months when callus grown in SH- or MS-
based liquid media supplemented with 7.0 µM kinetin was transferred onto solid MS-
based medium with either 0.45 µM 2,4-D or without hormones. Embryogenesis was
affected by the type of medium, plant growth regulators and duration of callus
exposure to cytokinins. The highest average numbers of embryos in the different
stages were achieved using SH liquid medium for the first culture and MS medium
without hormones after 30 days. Approximately 70% of somatic embryos germinated
on G medium. Furthermore, plants derived from somatic embryos were successfully
potted in soil, and they showed, except those derived from somatic embryos with
more than four cotyledons, genetic stability compared to mother plants. A highly
efficient regeneration system through adventitious shoot formation was also
developed in Schlumbergera cv. Alex and Rhipsalidopsis cv. CB5. Moreover, the
development of these efficient regeneration systems was further exploited and success
was demonstrated as the first report in obtaining Rhipsalidopsis cv. CB5 shoots
transgenic for the uidA gene and the selectable marker nptII gene. Some of the factors
influencing transformation of Rhipsalidopsis callus explants were evaluated.
Transformed Rhipsalidopsis calli were obtained by extended culture on media
containing 600 mg/l kanamycin. The pre-incubation of Agrobacterium tumefaciens in
SIM medium containing acetosyringone raised the frequency of transgenic calli.
Furthermore, a washing step with cefotaxime for the callus explants after co-culture
was necessary to remove the excess Agrobacterium. The removal of kanamycin from
the final medium together with the culture of the transformed calli under nutritional
stress led to the formation of transgenic adventitious shoots. With this approach, a
transformation efficiency of 22.7% was achieved. The results obtained in this study
suggested that Agrobacterium-mediated transformation is a promising approach for
generating new genotypes of these cacti.

ii
Dedication


To my
Family
and
Friends


With Love




iii
Acknowledgements

I would like to express my sincere appreciation and deep gratitude to my advisor Prof.
Dr. Margrethe Serek for her guidance, encouragement, patience and constant support.
I would like also to thank Dr. Sridevy Sriskandarajah for introducing me to the field
of tissue culture, for her valuable advice regarding my research project and for the
critical evaluation of this manuscript.

Special thanks go to Dr. Lilli Sander for her help with molecular methods. My
appreciation is also extended to Dr. Stefan Frello for the technical advice on various
methods throughout the course of this study. I would like to thank Dr. Michael
Hansen, for his help with scanning electron microscopy. Special thanks also go to
Lise Girsel, for her expertise in histology.

My thanks and gratitude also go to my fellow PhD students and other staff members
of the floriculture section in the Royal Veterinary and Agricultural University in
Copenhagen for their support and for providing a good working environment both in
the laboratory and in my office.

I would like also to thank the staff members of the floriculture section in the
University of Hannover for their readiness to help both on the personal and scientific
level. Thanks Dr. Traud Winkelmann for your suggestions and advice in various
aspects of this research project.

Special thanks go to Al-Balqa Applied University, Salt, Jordan for the PhD grant
which enabled me to successfully complete this doctoral study. Moreover, my
gratitude goes to the German Academic Exchange Service (DAAD) for the financial
support of a six-month German language course.

Lastly, I would like to thank my parents and my brother Naser for their
encouragement and moral support throughout this study.

iv
Table of Contents
Zusammenfassung……………………………………………………………………...i
Abstract……………………………………………………………………………......ii
Dedication…………………………………………………………………………….iii
Acknowledgements…………………………………………………………………...iv
List of Tables……………………………………………………………………...….ix
List of Figures…………………………………………………………………………x
List of Appendices……………………………………………………………………xi
Abbreviations………………………………………………………