Structural basis of the mitochondrial voltage-dependent anion channel VDAC I [Elektronische Ressource] / Thomas Meins

Thomas Meins

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 24
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 10 Mo

Extrait

Dissertation zur Erlangung des  Doktorgrades  der Fakultät für
Chemie und Pharmazie der Ludwig­Maximilians­ Universität München
Structural b asis o f t he m itochondrial
 v oltage­dependent a nion c hannel V DAC I
Thomas M eins
aus  München
2008Erklärung




Diese Dissertation wurde im Sinne von §13 Abs. 3 bzw. 4 der Promotionsordnung vom
29. Januar 1998 von Herrn Prof. Dr. Dieter Oesterhelt betreut.




Ehrenwörtliche Versicherung




Diese Dissertation wurde selbstständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.





München, am 08. September 2008


…………………………….
Thomas Meins







Dissertation eingereicht am: 08.09.2008

1. Gutachter: Prof. Dr. Dieter Oesterhelt

2. Gutachter: Prof. Dr. Karl-Peter Hopfner

Mündliche Prüfung am: 27.10.2008 Meinen Eltern & VerenaTABLE OF CONTENTS
1 Summary..................................................................................................................................................6
2 Introduction...............................................................................................................................................7
2.1 Mitochondrial structure and function.................................................................................................7
2.2 The mitochondrial outer membrane .................................................................................................8
2.3 The voltage dependent anion channel..............................................................................................8
 2.3.1 General function of VDAC........................................................................................................9
 2.3.2 The different isoforms  of the VDAC........................................................................................10
 2.3.3 Conductance, voltage dependency  and ion selectivity  of the VDAC......................................10
 2.3.4 The general structure of the VDAC........................................................................................12
 2.3.5 Fold and architecture of bacterial ­barrel membrane proteins  .............................................15
 2.3.6 Evidence for a ­barrel fold of VDAC ....................................................................................16
 2.3.7 Model of the proposed VDAC structure and its  gating mechanism........................................17
 2.3.8 The role of VDAC in mitochondrial complexes.......................................................................19
 2.3.8.1 Involvement of VDAC in complexes  of the energy  metabolism......................................20
 2.3.8.2 Involvement of VDAC in the mitochondrial phase of apoptosis......................................20
2.4 Conceptual formulation...................................................................................................................22
3 Materials  and methods............................................................................................................................24
3.1 Materials..........................................................................................................................................24
 3.1.1 General Instruments:..............................................................................................................24
 3.1.2 Consumables.........................................................................................................................24
 3.1.3 Kit systems.............................................................................................................................25
 3.1.4 Fine Chemicals.......................................................................................................................25
3.2 Strains  and vectors  ........................................................................................................................26
 3.2.1 Strains....................................................................................................................................26
 3.2.2 Vectors...................................................................................................................................26
3.3 Growth Media.................................................................................................................................26
 3.3.1 Antibiotics...............................................................................................................................26
 3.3.2 LB agar plates........................................................................................................................27
 3.3.3 LB broth.................................................................................................................................27
 3.3.4 TB broth.................................................................................................................................27
 3.3.5 Minimal medium.....................................................................................................................27
 3.3.6 Algal extract supplemented media (AES media) ...................................................................28TABLE OF CONTENTS
3.4 General Molecular Biological Techniques.......................................................................................29
 3.4.1 Preparation of electro­competent E. coli cells........................................................................29
 3.4.2 Transformation of E. coli cells................................................................................................30
 3.4.3 Determination of DNA concentrations....................................................................................30
 3.4.4 Plasmid amplification ............................................................................................................30
 3.4.5 Isolation of plasmid DNA from E. coli cells.............................................................................31
 3.4.6 Analysis  of plasmid DNA by  agarose gel electrophoresis......................................................31
 3.4.7 Sequencing of PDS56/RBSII­VDACIHis................................................................................31
 3.4.8 Site directed mutagenesis  of HVDAC1 .................................................................................32
 3.4.9 Preparation of E. coli DL39 [prep4]........................................................................................34
3.5 Protein expression and purification.................................................................................................34
 3.5.1 Heterologous  expression of HVDAC1 in E. coli......................................................................34
 3.5.1.1 Overproduction of HVDAC1 in E. coli  M15 [prep4].........................................................34
 3.5.1.2 Overproduction of selenomethionine labelled HVDAC1 in E. coli  M15 [prep4]..............34
2 15 13 3.5.1.3 Overproduction of   H,  N and  C labelled HVDAC1 in E. coli  M15 [prep4]..................34
 3.5.1.4 Overproduction of selective amino acid labelled HVDAC1 E. coli  in DL39 [prep4]........35
 3.5.2 Purification and refolding of HVDAC1 inclusion bodies..........................................................35
 3.5.2.1 Purification of  HVDAC1  inclusion bodies......................................................................35
 3.5.2.2 Refolding of denatured  HVDAC1..................................................................................36
 3.5.3 Purification of refolded HVDAC1 for NMR investigations............................................