Structure function studies of ABC transporters: HlyB from Escherichia coli and ChoX from Sinorhizobium meliloti [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Christine Oswald

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• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 15
• Langue: English
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Extrait

Structure-function studies of ABC transporters

HlyB from Escherichia coli
and
ChoX from Sinorhizobium meliloti


Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der
Mathemathisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf


vorgelegt von

Christine Oswald
aus Memmingen

Januar 2008
Aus dem Institut für Biochemie
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf












Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf




Referent: Prof. Dr. L. Schmitt
Koreferent: Prof. Dr. G. Groth

Tag der mündlichen Prüfung: 23.01.2008


























Meinen Eltern

Summary
ATP binding cassette (ABC) transporters represent a superfamily of ubiquitous membrane proteins
which utilize energy derived from binding and hydrolysis of ATP to fuel the translocation of
substrates. The transport substrates are highly diverse in their chemical characteristics and their size.
Generally, this superfamily can be divided in importers and exporters. In contrast to export systems,
archaeal and bacterial importers exhibit an additional substrate binding protein (SBP), which captures
the substrate and delivers it to the ABC transporter. Binding of the SBP to the transporter triggers ATP
hydrolysis and substrate transport. Notably, the substrate specificity of importers is solely determined
by the SBP, whereas for exporters the transmembrane domains account for substrate specificity.

Haemolysin B (HlyB), an ABC transporter from Escherichia coli, fuels the transport of the 107 kDa
toxin HlyA. Together with the membrane fusion protein HlyD and the outer membrane protein TolC
this ABC transporter constitutes a type I secretion system, which allows for substrate transport across
two membranes in a single step.
Central questions for a mechanistic understanding of ABC transporters are how substrate specificity is
determined and how substrate binding is triggering ATP binding and hydrolysis. As HlyA is a rather
large substrate with respect to the transporter, it is extremely intriguing to unravel the transport
mechanism of HlyB.
To give an insight into ABC transporter function, a structural determination of HlyB was anticipated.
HlyB was successfully overexpressed in Lactococcus lactis and purified to homogeneity by affinity
chromatography and gelfiltration. Crystallization studies allowed for the determination of first
conditions for a successful HlyB crystallization.

The choline transporter ChoXWV from Sinorhizobium meliloti represents an ABC importer.
Interestingly, it could be shown in vitro that the SBP binds not only choline but also acetylcholine.
Determination of the X-ray structure of the SBP ChoX provided a detailed picture of the molecular
determinants of choline and acetylcholine binding. ChoX is composed of two lobes, which together
form the substrate binding site consisting of an aromatic box. Comparison of acetylcholine binding
with carbamylcholine binding in the nicotinic acetylcholine receptor revealed similarities, which
provide first evidence for a common ancestor.
Most interestingly, different unliganded structures of ChoX allowed for the identification of a
rotational subdomain. Inward rotation of this subdomain upon substrate binding may present a
“sensor-transmitter switch”. Only if this “sensor-transmitter switch” is making contacts with the
substrate, binding of the SBP to the transporter triggers a series of events leading to ATP hydrolysis
and the import of substrate. The proposed “transport triggering mechanism” guarantees that ATP is
hydrolyzed only if the binding protein carries substrate.
Zusammenfassung
ATP binding cassette (ABC) Transporter bilden eine Klasse von Membranproteinen, die in allen
Bereichen des Lebens vorkommen. Die Gewinnung von Energie aus ATP-Bindung und Hydrolyse
ermöglicht es diesen Membranproteinen Substrate zu transportieren. ABC Transporter sind in
Exporter und Importer unterteilt. Im Gegensatz zu Exportern besitzen Importer eine zusätzliche
Untereinheit, das Substratbindeprotein (SBP), welches das Substrat erfasst und es an den Transporter
liefert. Die Bindung des SBP an den Transporter selbst induziert ATP-Hydrolyse und
Substrattransport. Während bei Exportern die Substratspezifität über die Transmembrandomänen
vermittelt wird, geschieht dies bei Importern interessanterweise nur über das SBP.

Haemolysin B (HlyB), ein ABC Transporter aus Escherichia coli, energetisiert den Transport des 107
kDa großen Toxins HlyA. Dieser ABC Transporter bildet zusammen mit dem Membranfusionsprotein
HlyD und dem äußeren Membranprotein TolC ein Typ I Sekretionssystem, welches das Substrat in
einem Schritt über zwei Membranen transportiert.
Für ein molekulares Verständnis des Mechanismus von ABC Transportern ist es von besonderem
Interesse, die Vermittlung der Substratspezifität zu verstehen. Weiterhin ist der Zusammenhang
zwischen Substratbindung und ATP-Hydrolyse ungeklärt. Die Aufklärung des Transportmechanismus
von HlyB erscheint besonders interessant, da HlyA im Vergleich zu seinem Transporter, ein sehr
großes Substrat darstellt. Um einen Einblick in den ABC Transportmechanismus zu erhalten, sollte
HlyB strukturell charakterisiert werden. Dazu wurde es in Lactococcus lactis überexpremiert und
mittels Affinitätschromatographie und Gelfiltration zur Homogenität aufgereinigt. Kristallisations-
studien ermöglichten die erfolgreiche Etablierung von Kristallisationsbedingungen für HlyB.

Der Cholin Transporter ChoXWV aus Sinorhizobium meliloti gehört der Gruppe der ABC Importer
an. In vitro Studien zeigten, dass das SBP dieses Transporters nicht nur Cholin sondern auch
Acetylcholin binden kann. Um ein molekulares Verständnis der Bindung von Cholin und Acetylcholin
zu erhalten, wurde die Kristallstruktur von ChoX in substratgebundenen Zuständen aufgeklärt. ChoX
besitzt zwei Domänen, die gemeinsam die Substratbindestelle bilden und eine aromatische Box
generieren. Der Vergleich der Acetylcholinbindung in ChoX mit der Bindung von Carbamylcholin im
nikotinischen Acetylcholinrezeptor, zeigt Ähnlichkeiten auf, die erstmals auf einen gemeinsamen
Vorläufer hindeuten. Die Strukturbestimmung von ChoX in unterschiedlichen ligandfreien
Konformationen erlaubte die Identifizierung einer noch nicht beschriebenen, rotierenden Subdomäne.
Da die Subdomäne bei Bindung des Liganden nach Innen rotiert, kann diese als Ligandsensor dienen.
Die Interaktion des SBP in ligandgebundenem Zustand mit dem Transporter induziert Veränderungen
im Transporter, die letztendlich zur ATP-Hydrolyse führen. Liegt das SBP in ligandfreiem Zustand
vor, so verhindert die Subdomäne eine effektive Interaktion mit dem Transporter. Damit kann ATP-
Verbrauch reguliert und verschwenderische ATP-Hydrolyse vermieden werden.

1 INTRODUCTION ------------------------------------------------------------------------------- 1 -
1.1 Membrane transport------------------------------------------------------------------------------------------- - 1 -
1.2 ABC transporters----------------------------------------------------------------------------------------------- - 2 -
1.2.1 The general blueprint of ABC transporters---------------------------------------------------------------- - 3 -
1.2.2 Structural information on ABC transporters -------------------------------------------------------------- - 5 -
1.2.3 Transport mechanism --------------------------------------------------------------------------------------- - 13 -
1.3 Protein translocation in bacteria --------------------------------------------------------------------------- - 15 -
1.3.1 Overview ----------------------------------------------------------------------------------------------------- - 15 -
1.3.2 Type I secretion---------------------------------------------------------------------------------------------- - 15 -
1.3.3 The haemolysin system - a paradigm for type I secretion ---------------------------------------------- - 17 -
1.4 The role of choline for Sinorhizobium meliloti ----------------------------------------------------------- - 19 -
1.4.1 Choline as phosphatidylcholine precursor---------------------------------------------------------------- - 19 -
1.4.2 The role of choline in osmoprotection -------------------------------------------------------------------- - 19 -
1.4.3 Choline as carbon and nitrogen source ------------------------------------------------------------------- - 20 -
1.4.4 Choline uptake ----------------------------------------------------------------------------------------------- - 20 -
1.5 Aims and objectives ------------------------------------------------------------------------------------------- - 21 -
2 MATERIALS AND METHOD