Struktur-, Dynamik- und Stabilitätsuntersuchungen an RNA mittels NMR-Spektroskopie [Elektronische Ressource] / von Jörg Rinnenthal

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• Publié le: 01 janvier 2010
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• Langue: Deutsch
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Extrait

Struktur-, Dynamik- und Stabilitätsuntersuchungen an
RNA mittels NMR-Spektroskopie


Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften

vorgelegt beim
Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
in Frankfurt am Main

von
Jörg Rinnenthal
aus Frankfurt am Main



Frankfurt am Main
2010

(D30)























































vom Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie der
Johann Wolfgang Goethe-Universität als Dissertation angenommen.

Dekan: Prof. Dr. Dieter Steinhilber
Gutachter: Prof. Dr. Harald Schwalbe und Prof. Dr. Clemens Glaubitz

Datum der Disputation: 19.10.2010












































„Freude am Schauen und Begreifen ist die schönste Gabe der Natur.“
Albert Einstein


































Inhaltsverzeichnis-VII

Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis........................................................................................ XII
1 Einleitung............................................................................................................... 1-1
1.1 Strukturbiologie ...................................................................................................... 1-1
1.2 NMR-Spektroskopie................................................................................................. 1-3
1.2.1 Resonanzzuordnung...................................................................................... 1-3
1.2.2 Strukturaufklärung ........................................................................................ 1-4
1.2.2.1 Chemische Verschiebung (CSI, TALOS) .................................................. 1-5
1.2.2.2 NOE bzw. ROE.......................................................................................... 1-5
31.2.2.3 Skalare J-Kopplungen............................................................................... 1-6
1.2.2.4 Residuale dipolare Kopplungen (RDCs).................................................... 1-8
1.2.2.5 Residuale chemische Verschiebungsanisotropie (rCSA) ........................... 1-9
c1.2.2.6 Kreuzkorrelierte Relaxationsraten ( Г ) ...................................................... 1-9
h1.2.2.7 Skalare J-Kopplungen............................................................................. 1-10
1.2.2.8 Austausch mit dem Lösungsmittel........................................................... 1-11
1.2.2.9 Paramagnetische Relaxationsbeschleunigung (PRE)............................... 1-12
1.2.3 Funktion, Dynamik und Stabilität ............................................................... 1-12
1.2.3.1 Schnelle Dynamik.................................................................................... 1-13
1.2.3.2 Schneller Austausch................................................................................. 1-14
1.2.3.3 Mittlerer Austausch.................................................................................. 1-16
1.2.3.4 Langsamer Austausch .............................................................................. 1-17
2 FourU RNA-Thermometer: Beschreibung der temperaturabhängigen
Basenpaarstabiliäten sowie des Schmelzvorgangs des Salmonella FourU
RNA-Thermometers............................................................................................ 2-20
2.1 Einleitung.............................................................................................................. 2-20
2.2 Material und Methoden......................................................................................... 2-24
2.2.1 NMR-Spektroskopie ................................................................................... 2-24
2.2.1.1 Resonanzzuordnung der Iminoprotonen .................................................. 2-24
2.2.1.2 Resonanzzuordnung aller NMR-aktiven Kerne der 4U-hp2-wt RNA ..... 2-25
2.2.1.3 „Inversion Recovery“ Experimente.......................................................... 2-30
2.2.2 RNA-Präparation ........................................................................................ 2-31
2.2.3 Native Gelelektrophorese............................................................................ 2-31
2.2.4 Denaturierende Gelelektrophorese.............................................................. 2-32
Inhaltsverzeichnis-VIII

2.2.5 CD-Spektroskopie....................................................................................... 2-32
2.2.6 Analyse der Iminoprotonenaustauschraten ................................................. 2-35
2.2.7 Bestimmung der Mononukleotid-Iminoprotonenaustauschraten ................ 2-44
2+2.2.8 Nachweis und Lokalisierung von Mg -Bindestellen ................................. 2-45
2.2.8.1 Analyse der Änderungen der Chemischen Verschiebung........................ 2-45
2.2.8.2 Linienverbreiterung durch paramagnetische Ionen.................................. 2-46
2+ 3+2.2.8.3 Lokalisierung von Mg -Bindestellen mit Hilfe von Co(NH ) ............ 2-49 3 6
2+2.2.8.4 Die Mg -Abhängigkeit des Schmelzpunktes T der RNA ..................... 2-50 m
2.3 Ergebnisse und Diskussion.................................................................................... 2-51
2.3.1 Probenpräparation ....................................................................................... 2-51
2.3.2 NMR-Resonanzzuordnung.......................................................................... 2-52
2.3.2.1 nzzuordnung Iminoprotonen.............................................. 2-52
2.3.2.2 Resonanzzuordnung aller NMR-aktiver Kerne der 4U-hp2-wt RNA...... 2-56
2.3.3 Temperaturabhängige Austauschraten der offenen Konformation.............. 2-64
2.3.4 Bestimmung der Iminoprotonenaustauschraten und deren
Temperaturabhängigkeit mittels NMR-Spektroskopie................................ 2-65
2.3.5 Thermodynamische Stabilität der einzelnen Nukleobasen.......................... 2-69
2.3.5.1 Einfluss von MgCl auf die thermodynamische Stabilität einzelner 2
Nukleobasen............................................................................................. 2-72
2.3.6 Der thermische Entfaltungsübergang des RNA-Thermometers.................. 2-78
2.3.7 Enthalpie-Entropie-Korrelationen und deren Auswirkungen...................... 2-83
2.3.7.1 Signifikanz der Enthalpie-Entropie-Korrelationen (EEK) ....................... 2-89
2.3.8 Thermodynamische Analyse der globalen Entfaltung des Wildtyps sowie
zweier Mutanten des FourU RNA-Thermometers ...................................... 2-90
2+2.3.9 Nachweis und Lokalisierung von Mg -Bindestellen innerhalb des FourU
RNA-Thermometers.................................................................................... 2-93
2+2.3.9.1 Mg -Titration der 4U-hp2-wt RNA........................................................ 2-93
2+2.3.9.2 Lokalisierung der Mg -Bindestelle der 4U-hp2-wt RNA über Analyse
der Linienverbreiterungen ausgelöst durch paramagnetische
2+Mn -Ionen............................................................................................... 2-96
2+ 3+2.3.9.3 Lokalisierung von Mg -Bindestellen mit Hilfe von Co(NH ) ............ 2-98 3 6
2+2.3.9.4 Bestimmung der Mg -Dissoziationskonstante K mittels Mg
CD-Spektroskopie.................................................................................. 2-100
3 Dynamische Untersuchungen am Phosphodiesterrückgrat einer
perdeuterierten cUUCGg-tetraloop-RNA mittels
31P-NMR-Relaxationsanalyse ........................................................................... 3-102
Inhaltsverzeichnis-IX

3.1 Einleitung............................................................................................................ 3-102
3.2 Methoden............................................................................................................. 3-105
3.2.1 Probenpräparation ..................................................................................... 3-105
3.2.2 Native Gelelektrophorese........................................................