Studies on ABC transporters from human liver in heterologous expression systems [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Jan Stindt

Dr. Obstacle Peanut

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• Publié par: heinrich-heine-universitat_dusseldorf
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 59
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 16 Mo

Extrait

Studies on ABC Transporters from Human Liver
in Heterologous Expression Systems




Inaugural-Dissertation


zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf





vorgelegt von

Jan Stindt

aus Kiel




Düsseldorf, 2010




Studies on ABC Transporters from Human Liver
in Heterologous Expression Systems




Inaugural-Dissertation


zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf







vorgelegt von

Jan Stindt

aus Kiel




Düsseldorf, im Dezember 2010



Aus dem Institut für Biochemie
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

















Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch- Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf.





Referent: Prof. Dr. Lutz Schmitt
Koreferent: PD Dr. Ulrich Schulte





Tag der mündlichen Prüfung: !


















»...hier können wir die Hände bis an den Ellenbogen in das stecken, was man
Abenteuer nennt.«

- Miguel de Cervantes (1605) El ingenioso hidalgo Don Quixote de la Mancha












meiner Familie












Summary
Today, the physiological function of canalicular export systems of the human liver in detoxification, bile
generation and secretion is clearly defined. Most membrane proteins taking part in this function are
members of the ATP binding cassette (ABC) transporter family and perform primary active substrate
transport energized by ATP hydrolysis. On a molecular level, little knowledge exists about the relation
between mutations in these membrane proteins and the diseases they are associated with.
Convenient in vivo systems are limited and cannot answer many questions of molecular function. To
gain mechanistic insights into both wild type and mutated transporters, in vitro systems are
indispensible that are of a very limited availability.
The aim of this thesis was to establish suitable in vitro systems for human ABC transporters that
are expressed in the apical membrane of polarized hepatocytes. Here, the human bile salt export
pump (BSEP, ABCB11) and the multidrug resistance protein 3 (MDR3, ABCB4) play an important role
in bile secretion, and their malfunction is associated with severe hereditary diseases like Progressive
Hereditary Intrahepatic Cholestasis (PFIC) type 2 and 3. Heterologous overexpression is a vital
necessity for in vitro studies, because membrane proteins, especially those from human, are quite
unstable and of rather low abundance in their native tissue. In contrast to mammalian cell culture, the
yeasts Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris provide comparatively easy and well-
characterized expression systems for polytopic membrane proteins. A challenge associated with
BSEP and MDR3 is the instability of their coding sequences in Escherichia coli that has been a strong
limiting factor in previous studies on both, and especially on clinically relevant mutations in these, as
the latter are not easily generated. The results of this thesis can be summarized as follows:
I) The first-time heterologous expression in S. cerevisiae yeast of both human BSEP and MDR3 was
achieved, both chromosomally and from plasmid. For the low-expressing BSEP, an expression screen
was devised that did not lead to an improved expression. The compatible osmolyte glycerol was found
to function as a chemical chaperone for BSEP, leading to an estimated twofold increase in expression.
For MDR3 it was found that the his tag position had a dramatic impact on expression levels.
II) In S. cerevisiae, the C-terminally his-tagged MDR3 could be expressed at a level comparable to
MDR1 which yields milligram amounts per litre of culture. Human MDR3 could be detergent-
solubilized and purified to amounts that for the first time allowed its detection on a Coomassie-stained
SDS-PAGE gel.
III) The yield of BSEP could be improved substantially by switching the expression host from S.
cerevisiae to P. pastoris.
IV) In order to establish expression in both yeast systems, a complete workflow was designed and
implemented that allows the cloning of the unstable BSEP and MDR3 coding sequences without the
use of E. coli. Instead, the cloning strategy can completely rely on the powerful homologous
recombination machinery of S. cerevisiae. The workflow includes a new site-directed mutagenesis
procedure that is also independent of E. coli usage and enables the rapid recreation of clinically
relevant BSEP and MDR3 mutations in both mammalian cell culture and the yeast expression
systems. This has previously been a complicated and time-consuming procedure as the attempt to
introduce targeted mutations regularly led to random deletions within the constructs.
As a result of this work, clinically relevant mutants of BSEP and MDR3 are now generated much
faster, and several BSEP variants are currently being studied in mammalian cell culture and in vitro.
I Zusammenfassung
Die physiologische Funktion kanalikulärer Transportsysteme in der menschlichen Leber ist heute klar
definiert. Die Mehrheit der beteiligten Membranproteine gehören zur Familie der ATP-Bindekassette
(ABC)-Transporter und vermitteln den primär-aktiven Transport ihrer Substrate unter ATP-Hydrolyse.
Auf molekularer Ebene sind die Beziehungen zwischen Mutationen in diesen Membranproteinen und
den damit assoziierten Krankheiten noch weitgehend unverstanden. In vivo-Systeme sind für die
Untersuchung vieler Fragestellungen auf molekularer Ebene ungeeignet. Um mechanistische
Einblicke in die Funktionsweise von Wildtyp als auch mutierten Transportern zu erlangen, werden in
vitro-Systeme benötigt.
Ziel dieser Doktoarbeit war, geeignete in vitro-Systeme für humane ABC-Transporter
bereitzustellen, die in der kanalikulären Membran der Hepatozyten lokalisiert sind. Die
Gallensalzexportpumpe (BSEP, ABCB11) und das Multidrogenresistenzprotein 3 (MDR3, ABCB4)
nehmen wichtige Rollen bei der Sekretion von Gallenbestandteilen ein. Ihre Fehlfunktion ist mit
schweren erblichen Erkrankungen wie der Progressiven Familiären Intrahepatischen Cholestase
(PFIC) Typ 2 und 3 verbunden. Ihre heterologe Überexpression ist eine wichtige Voraussetzung für in
vitro-Studien, da Membranproteine recht instabil sind und in ihrem nativem Gewebe oft nur in geringer
Menge vorkommen. Im Gegensatz zu Säugetierzellkultur sind die beiden Hefen Saccharomyces
cerevisiae und Pichia pastoris leicht handzuhabende und gut charakterisierte Expressionssysteme für
Membranproteine. Eine Herausforderung in bezug auf BSEP und MDR3 ist die Instabilität der
kodierenden DNS-Sequenzen in Escherichia coli, die in vorherigen Studien ein limitierender Faktor
war. Speziell Studien an Transportermutationen gestalten sich schwierig, da die Mutagenese der
kodierenden Sequenzen stark erschwert ist. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit können wie folgt
zusammengefaßt werden:
I) Die erstmalige heterologe Expression von BSEP und MDR3 in Bäckerhefe gelang sowohl
chromosomal als auch plasmidgebunden. Da hier die Expression von BSEP nur sehr gering war,
wurde ein Expressionstest verschiedener Promotoren durchgeführt, der zu keiner Expressions-
steigerung führte. Der Zusatz von Glycerin, einem kompatiblen Osmolyten, zu den Hefekulturen
bewirkte eine zweifache Expressionssteigerung von BSEP. Glycerin diente hier als eine chemische
Faltungshilfe. Für MDR3 wurde gezeigt, daß die Position des Histidin-Affinitätsanhängsels die
Expression signifikant beeinflußte.
II) Ein carboxyterminal mit einem Histidin-Affinitätsanhängsel fusioniertes MDR3 konnte in Bäckerhefe
in Mengen exprimiert werden, die mit denen hier für humanes MDR1 erzielten vergleichbar sind.
MDR3 konnte mit Detergenzien solubilisiert und anschließend in Mengen aufgereinigt werden, die
erstmalig die Detektion auf einem mit Coomassie-Farbstoff gefärbten SDS-Proteingel ermöglichten.
III) Die Ausbeute an rekombinantem BSEP konnte durch Wechsel des Expressionssystems von der
Bäckerhefe auf die methylotrophe Hefe Pichia pastoris deutlich erhöht werden. Aus diesem kann
BSEP jetzt in präparativen Mengen solubilisiert und aufgereinigt werden.
IV) Zur Etablierung der Expression in beiden Hefesystemen wurde ein kompletter Arbeitsablauf
realisiert, der die Klonierung der instabil