The effect of mitochondrial toxins on cytochrome c oxidase subunit IV isoforms and its consequences on mitochondrial function and neural cell survival [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Magdalena Maria Misiak

Magda Misiak

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• Publié par: rheinisch-westfalischen_technischen_hochschule_-rwth-_aachen
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 30
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

The effect of mitochondrial toxins on cytochrome c oxidase
subunit IV isoforms and its consequences on mitochondrial
function and neural cell survival





Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften
der RWTH Aachen Universität
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der
Naturwissenschaften genehmigte Dissertation


vorgelegt von


Diplom-Biotechnologin
Magdalena Maria Misiak
aus Krakau, Polen


Berichter: PD Dr. Susanne Arnold
Universitätsprofessor Dr. Hermann Wagner



Tag der mündlichen Prüfung: 16. September 2010

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
































2 Contents
1   Contents..............................................................................................................................3
     Abbreviations.....................................................................................................................6
     List of figures and tables..................................................................................................9
2 General introduction......................................................................................................11
2.1 Neural cells in the brain: neurons versus astrocytes.................................................11
2.1.1 Neurons..........................................................................................................................11
2.1.2 Astrocytes......................................................................................................................12
2.2 The role of mitochondria in energy production and oxidative stress....................14
2.2.1 Mitochondria.................................................................................................................14
2.2.2 Mitochondrial respiratory chain: energy supply and oxidative stress.................15
2.3  complex IV ‐ a potential regulator in neurodegeneration.............18
2.3.1 Mitochondrial complex IV ‐ cytochrome c oxidase (COX).....................................18
2.3.2 Cytochrome c oxidase subunit IV (COX IV) and its isoforms................................20
2.4 Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative disorders..................................21
2.4.1 Neurodegeneration in general....................................................................................21
2.4.2 Mitochondrial dysfunction in Huntington’s disease...............................................22
2.4.3   in Parkinson’s disease..................................................23
3 Scope of the study...........................................................................................................25
4 Material and methods.....................................................................................................26
4.1 Cell culture........................................................................................................................26
4.1.1 Primary astrocyte culture............................................................................................26
4.1.2 Primary neuronal culture27
4.1.3 Treatment of cell culture..............................................................................................27
4.1.4 Small interfering RNA (siRNA) transfection............................................................28
4.2 Biochemical methods......................................................................................................29
4.2.1 Reverse Transcription..................................................................................................29
4.2.2 Real‐time PCR analysis................................................................................................29
4.2.3 SDS‐ PAGE and Western blot.....................................................................................30
34.2.4 Protein determination..................................................................................................31
4.2.5 Fluorescence immunocytochemistry.........................................................................32
4.3 Functional assays on cells and mitochondria.............................................................33
4.3.1 Intracellular ATP determination................................................................................33
4.3.2  reactive oxygen species detection........................................................33
4.3.3 Glycogen assay..............................................................................................................34
4.3.4 Preparation of mitochondria from primary astrocytes...........................................34
4.3.5 Hydrogen peroxide detection in mitochondria35
4.3.6 Polarographic measurements.....................................................................................35
4.4 Cell viability assays.........................................................................................................36
4.4.1 Apoptosis and necrosis assays....................................................................................36
4.4.2 Measurement of lactate dehydrogenase (LDH) activity by LDH assay...............37
4.4.3 CellTiter‐Blue® Cell Viability Assay.........................................................................37
5 Brain region‐specific vulnerability of astrocytes in response to 3‐nitropropionic 
acid is mediated by cytochrome c oxidase isoform expression...................................39
5.1 Abstract..............................................................................................................................39
5.2 Introduction......................................................................................................................39
5.3 Materials and methods....................................................................................................40
5.4 Results................................................................................................................................44
5.5 Discussion.........................................................................................................................51
6 Cytochrome c oxidase isoform IV‐2 is involved in 3‐nitro‐propionic acid‐
induced toxicity in striatal astrocytes...............................................................................55
6.1 Abstract..............................................................................................................................55
6.2 Introduction......................................................................................................................55
6.3 Material and methods.....................................................................................................56
6.4 Results................................................................................................................................59
6.5 Discussion.........................................................................................................................67
7 Gender‐specific role of mitochondria in the vulnerability of  
6‐hydroxydopamine‐treated mesencephalic neurons...................................................72
7.1 Abstract..............................................................................................................................72
4 7.2 Introduction......................................................................................................................72
7.3 Materials and methods....................................................................................................73
7.4 Results................................................................................................................................77
7.5 Discussion.........................................................................................................................86
8 General discussion.......................................................................................................92
9 Summary97
10 Zusammenfassung99
11 Acknowledgements..................................