The human G protein-coupled receptor GPR30 [Elektronische Ressource] : interaction partners and expression analysis in endothelial cells / Valeria Zazzu. Gutachter: Patricia Ruiz Noppinger ; Peter-Michael Kloetzel ; Franz Theuring

Valeria Zazzu

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• Biologie

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• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 38
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 7 Mo

Extrait

Center for Cardiovascular Research, Charité, Berlin &
Max-Planck Institut for Molecular Genetics, Berlin


The human G Protein-Coupled Receptor GPR30:
interaction partners and expression analysis in
endothelial cells


Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin


von
Valeria Zazzu


Präsident: Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz
Dekan: Prof. Dr. Andreas Herrmann

Gutachter/innen:
1. Prof. Dr. Patricia Ruiz Noppinger
2. Prof. Dr. Peter-Michael Kloetzel
3. Prof. Dr. Franz Theuring

Datum der mündl. Prüfung: 02.03.2011




























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ZUSAMMENFASSUNG
Im Jahr 1997 wurden der Orphan-G-Protein-gekoppelte Rezeptor 30 (GPR30) aus
menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) kloniert, die Fluid Shear Stress (FSS),
einer mechanischen Kraft, die auf Blutgefäße wirkt, ausgesetzt waren. In dieser Studie von
Takada et al konnte gezeigt werden, dass die Expression von GPR30 durch die FSS-
Behandlung im Vergleich zu unbehandelten HUVEC-Zellen deutlich induziert
wurde. Daraufhin wurde in einer Studie im dem Labor, in dem die Experimente für diese
Arbeit durchgeführt wurden, die zelluläre und gewebsspezifische Expression von GPR30 in
GPR30-LacZ Reportergen-Mäusen untersucht. Es konnte eine Expression von GPR30
vorwiegend in den Endothelzellen der kleinen Arterien verschiedenster Gewebetypen
nachgewiesen werden.
Vor einigen Jahren wurde von zwei unabhängigen Gruppen postuliert, dass GPR30, 17-β-
Östradiol (E2) direkt binden kann und dadurch rasche nicht-genomische Signale
vermittelt. Im Gegensatz dazu haben verschiedene andere Veröffentlichungen gezeigt, dass
E2 nicht spezifisch an GPR30 bindet. Trotz der Kontroverse, ob es sich bei GPR30 um einen
Östrogenrezeptor oder um einen Orphan-Rezeptor handelt, ist bislang nichts über seine
Interaktion zu anderen Proteinen und deren Wechselwirkung bekannt. Deswegen, und
aufgrund der Tatsache, dass mehrere Berichte darauf hindeuten, dass GPCRs mit mehreren
Proteinen (neben denen, die in der traditionellen Vorstellung mit heterotrimeren G-Proteine
wechselwirken) interagieren bzw. von diesen reguliert werden, war ein Ziel dieser Arbeit,
Interaktionspartner von menschlichen GPR30 zu identifizieren und folglich ein humanes
vaskuläres in vitro Modell zu etabliren, um die potentiellen Interaktionen von GPR30 sowie
die downstream-Effekte der Wechselwirkung zwischen GPR30 und den neuen
Interaktionspartner des vaskulären Modells auf Transkriptebene zu evaluieren.
Ein Screening einer humanen kardiovaskulären cDNA-Bibliothek mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid
(Y2H)-Systems führte zur Identifizierung mehrerer Interaktionspartner für GPR30, darunter
das PALS1-assoziierten Tight Junction-Protein (PATJ) und das FUN14 domain containing 2-
Protein (FUNDC2). Durch anschließende Ko-Immunopräzipitation (CoIP)-Experimente
konnte die Interaktion von GPR30 mit PATJ validiert werden. Zusätzlich wurde eine teilweise
zelluläre Ko-Lokalisation gefunden. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit die Wirkung von
FSS auf die Expression von GPR30 in HUVEC-Zellen bestätigt und ebenfalls in weiteren
anderen Endothelzellen gezeigt werden. So wurde eine Hoch-regulierung der Expression
von GPR30 induziert durch FSS in humanen arteriellen Nabelschnul-Endothelzellen
(HUAECs), humanen Aorten-Endothelzellen (HAoECs) und in humanen mikrovaskulären
Endothelzellen (HMEC-1) gefunden, was darauf hindeutet, dass GPR30 in der Tat eine
wichtige Rolle in der vaskulären Physiologie spielt. Abschließend wurde die Rolle von
GPR30 und PATJ bei der Reaktion auf FSS auf transkriptioneller Ebene in HMEC-1-Zellen
ii
genomweit untersucht. Interessanterweise war eine Gruppe von Genen aufgrund von FSS in
Zellen, die GPR30 überexprimierten dereguliert, als alleine durch FSS. Darunter waren
Gene, die zum einen eine wichtige Rolle bei verschiedenen Funktionen und der
Morphogenese von Gefäßen spielen, z.B. Plexin D1 (PLXND1) und Troponin I Typ 3 (TNNI3)
und zum anderen an der Entwicklung und der Funktion des endokrinen Systems beteiligt
sind, z.B. der ras-related and E2-regulated growth inhibitor (RERG), der in der E2-
Signalkaskade involviert ist. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit zum ersten Mal die
Interaktion von GPR30 und PATJ und beschreibt ein Modell, mit dessen Hilfe die Funktion
von GPR30 in Endothelzellen weiter untersuchen könnte.
Schlagwörter: GPR30, fluid shear stress, PATJ, endothelzellen.


iii

ABSTRACT
In 1997, the orphan G protein-coupled receptor 30, GPR30 was cloned using human
umbilical vein endothelial cells (HUVECs) exposed to fluid shear stress (FSS), one of the
mechanical forces acting on blood vessels. Takada et al. have shown that the level of
GPR30 expression was markedly induced in response to FSS. Subsequently, in a study
performed in the laboratory where the work for this thesis was carried out, the cellular and
tissue distribution of GPR30 were investigated in GPR30-LacZ reporter mice and the
expression was found predominantly in the endothelial cells of small arteries in several tissue
types. GPR30, was claimed some years later to bind 17-β-estradiol (E2) directly and to
mediate rapid non-genomic signalling. In contrast, various reports have indicated that E2 fails
to bind GPR30 in a specific manner. Despite the controversy on whether GPR30 is an
estrogen receptor or still an orphan receptor, nothing is known at present about its relation
and interaction with other proteins. Therefore, also according to several reports suggesting
that GPCRs interact with and are regulated by several other proteins beyond the established
role of heterotrimeric G proteins, the aim of the work described in this thesis was to identify
human GPR30 protein interaction partners and to establish a human vascular in vitro model
in order to evaluate the potential role of GPR30 and the downstream effects of the interaction
between GPR30 and new interaction partners in a vascular model at transcript level. The
screening of a human heart cDNA library using the yeast two-hybrid (Y2H) assay led to the
identification of several interaction partners for GPR30, among them PALS1-associated tight
junction protein (PATJ) and the FUN14 domain containing 2 (FUNDC2). These interactions
were verified by co-immunoprecipitation (CoIP) experiments and the interaction of GPR30
with PATJ could be confirmed. The effect of FSS on the expression of GPR30 was confirmed
in HUVECs and was detected in other endothelial cell types. In Human Umbilical Arterial
(HUAECs), Human Aortic (HAoECs) and Human Microvascular Endothelial Cells (HMEC-1)
GPR30 was also found up-regulated upon FSS, suggesting that GPR30 may indeed play a
key role in vascular physiology. Finally, the role of GPR30 and PATJ in the FSS response
was investigated at the genome-wide transcript level in HMEC-1 cells. Interestingly, a
different panel of genes was deregulated owing to FSS in cells over-expressing GPR30
compared to FSS alone. These included genes that play an important role in vascular
function and morphogenesis, e.g. plexin D1 (PLXND1) and troponin I type 3 (TNNI3), and in
the development and function of the endocrine system, e.g. the ras-related and E2-regulated
growth inhibitor (RERG), which is involved in E2 signalling. Taken together, this study
provides evidence for the first time for an interaction between GPR30 and PATJ and
proposes a model to further evaluate the role of GPR30 in endothelial cells.
Keywords: GPR30, fluid shear stress, PATJ, endothelial cells.
iv
TABLE OF CONTENTS
ZUSAMMENFASSUNG.............................................................................................. II
ABSTRACT ...............................................................................................................IV
TABLE OF CONTENTS .............................................................................................V
ABBREVIATIONS ...................................................................................................VIII
LIST OF FIGURES ....................................................................................................XI
LIST OF TABLES....................................................................................................XIII
1 INTRODUCTION ................................................................................................. 1
1.1 G protein-coupled receptors (GPCRs)............................................................................................. 1
1.1.1 Classification of GPCRs ................................................................................................................... 2
1.1.2 Activation and termination of GPCR signalling ....