Une approche moléculaire de l'astringence des vins : utilisation de sondes pour l'étude des interactions entre protéines de la salive et polyphénols

Adéline Delcambre

Description

Sous la direction de Jean-Marie Schmitter
Thèse soutenue le 03 décembre 2010: Bordeaux 1
L’astringence est une sensation de sécheresse ressentie en bouche lors de la dégustation des vins rouges, qui résulte de la complexation entre les polyphénols du vin et les protéines de la salive, provoquant une diminution de lubrification en bouche. Parmi les protéines salivaires, les protéines riches en prolines (PRP) sont connues pour leur capacité à se lier aux polyphénols et à précipiter avec eux. Une meilleure connaissance de ce phénomène au niveau moléculaire est nécessaire pour le comprendre et le maîtriser. Il a été montré qu’un peptide de quatorze acides aminés, IB714, dont la séquence est conservée au sein des protéines riches en proline, était un mime représentatif des PRP. Un travail préliminaire par spectrométrie de masse résolue en énergie a permis de caractériser les interactions entre des polyphénols et le peptide IB714. Une échelle d’affinité en phase gazeuse a ainsi été déterminée. Cependant, cette méthodologie d’analyse d’un système modèle ne permet pas de s’accommoder de la complexité du vin. C’est pourquoi nous avons conçu une nouvelle stratégie reposant sur l'utilisation de sondes moléculaires immobilisée sur des billes magnétiques. Dans un premier temps nous avons élaboré une sonde peptidique, en greffant le peptide IB714 sur des billes magnétiques portant des fonctions carboxylates. Cette sonde peptidique a ensuite été étudiée avec des polyphénols modèles. Après sédimentation des billes magnétiques, les polyphénols non captés par la sonde ont été dosés par spectrométrie de masse en utilisant un étalon interne. Une échelle d'affinité en phase liquide a été établie de cette manière. Les positions relatives des polyphénols modèles sur cette échelle sont similaires à celles qui ont été établies en phase gazeuse. Dans un second temps, nous avons construit sur le même principe une sonde polyphénolique. Pour cela, un polyphénol modifié chimiquement a été immobilisé sur des billes magnétiques portant des fonctions amines. Cette sonde polyphénolique a été utilisée pour étudier l'interaction avec le peptide IB714. Par ailleurs, pour préparer une étude des interactions entre polyphénols et protéines salivaires avec des mélanges plus complexes que les systèmes modèles, une étude de fractionnement des protéines salivaires a été entreprise, permettant notamment de d’éliminer l’amylase, protéine majoritaire de la salive humaine. De même, un fractionnement d’un vin rouge a été entrepris pour disposer de fractions de tannins caractérisées par spectrométrie de masse. La sonde peptidique est l’outil moléculaire qui offre le plus de perspectives de développement ultérieur.
-Spectrométrie de masse
-Astringence
-Protéine de la salive
-Polyphénols
-Sondes moléculaires
Astringency is a pucker or dry mouth sensation, typically experimented with red wine tasting, that finds its origin in the complexation of polyphenols with salivary proteins, producing a reduced lubrication of the oral cavity. Among salivary proteins, proline rich proteins (PRPs) are well known for their capacity to bind and precipitate dietary polyphenols. A better knowledge of this phenomenon at the molecular level is required in order to master it. A 14 amino acid stretch from the PRP IB7 has been synthesized and shown to be a representative mimic of PRPs. Previous work by Energy Resolved Mass Spectrometry (ERMS) allowed characterizing the keys parameters of the interactions between these polyphenols and the IB714 probe. An affinity scale in the gas phase was determined in this way. However, the ERMS approach was hardly compatible with the complexity of wine polyphenols, and a validation of the affinity scale in condensed phase was required. Thus, we designed a new strategy relying on the use of molecular probes immobilized on magnetic beads. A peptidic probe was obtained by grafting the synthetic IB714 peptide on magnetic beads bearing carboxylate functions, and used to study its interaction with model polyphenols. After magnetic precipitation of the beads, unbound polyphenols left in the supernatant were quantified by mass spectrometry using an internal standard. An affinity scale in liquid phase was established in this way. Relative positions of model polyphenols on this latter scale were similar to those determined by ERMS. A polyphenolic probe was obtained by grafting a model polyphenol on beads bearing amine functions. This probe has been used to study the interaction with IB714. To prepare further work on more complex mixtures, attempts were made to fractionate human saliva; this allowed eliminating amylase, the major salivary protein. Wine tannins were also fractionated, in order to isolate condensed polyphenols that are characterized by mass spectrometry. The peptidic probe is the molecular tool that offers the best perspectives for future work.
-Mass spectrometry
-Astringency
-Salivary proteins
-Polyphenols
-Molecular probes
Source: http://www.theses.fr/2010BOR14124/document

Sujets

• Spectrométrie de masse
• Astringence
• Polyphénol

Informations

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• Poids de l'ouvrage: 4 Mo

Extrait

N° d’ordre : 4124


THESE
présentée à
L’UNIVERSITE BORDEAUX I
ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES
par Adéline DELCAMBRE
POUR OBTENIR LE GRADE DE
DOCTEUR
SPECIALITE : CHIMIE ANALYTIQUE ET ENVIRONNEMENT

UNE APPROCHE MOLECUALIRE DE L’ASTRINGENCE DES VINS: UTILISATION DE
SONDES POUR L’ETUDE DES INTERACTIONS ENTRE PROTEINES DE LA SALIVE
ET POLYPHENOLS

Soutenue le 3 décembre 2010

Après avis de:
M. Gérard BOLBACH, Directeur de Recherche CNRS Rapporteur
M. Jean-Michel MERILLON, Professeur d’Université Bordeaux 2 Rapporteur

Devant la commission d’examen formée de :
M. Gérard BOLBACH, Directeur de Recherche CNRS Rapporteur
M. Jean-Michel MERILLON, Professeur d’Université Bordeaux 2 Rapporteur
M. Michel LAGUERRE, Directeur de Recherche CNRS Examinateur
M. Bernard GALLOIS, Dir de Recherche CNRS E
M. Jean-Marie SCHMITTER, Professeur d’Université Bordeaux 1 Directeur de thèse

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RESUME
L’astringence est une sensation de sécheresse ressentie en bouche lors de la dégustation des vins
rouges, qui résulte de la complexation entre les polyphénols du vin et les protéines de la salive, provoquant une
diminution de lubrification en bouche. Parmi les protéines salivaires, les protéines riches en prolines (PRP) sont
connues pour leur capacité à se lier aux polyphénols et à précipiter avec eux. Une meilleure connaissance de ce
phénomène au niveau moléculaire est nécessaire pour le comprendre et le maîtriser. Il a été montré qu’un
peptide de quatorze acides aminés, IB7 dont la séquence est conservée au sein des protéines riches en 14,
proline, était un mime représentatif des PRP. Un travail préliminaire par spectrométrie de masse résolue en
énergie a permis de caractériser les interactions entre des polyphénols et le peptide IB7 . Une échelle d’affinité 14
en phase gazeuse a ainsi été déterminée.
Cependant, cette méthodologie d’analyse d’un système modèle ne permet pas de s’accommoder de la
complexité du vin. C’est pourquoi nous avons conçu une nouvelle stratégie reposant sur l'utilisation de sondes
moléculaires immobilisée sur des billes magnétiques. Dans un premier temps nous avons élaboré une sonde
peptidique, en greffant le peptide IB7 sur des billes magnétiques portant des fonctions carboxylates. Cette 14
sonde peptidique a ensuite été étudiée avec des polyphénols modèles. Après sédimentation des billes
magnétiques, les polyphénols non captés par la sonde ont été dosés par spectrométrie de masse en utilisant un
étalon interne. Une échelle d'affinité en phase liquide a été établie de cette manière. Les positions relatives des
polyphénols modèles sur cette échelle sont similaires à celles qui ont été établies en phase gazeuse. Dans un
second temps, nous avons construit sur le même principe une sonde polyphénolique. Pour cela, un polyphénol
modifié chimiquement a été immobilisé sur des billes magnétiques portant des fonctions amines. Cette sonde
polyphénolique a été utilisée pour étudier l'interaction avec le peptide IB7 . 14
Par ailleurs, pour préparer une étude des interactions entre polyphénols et protéines salivaires avec des
mélanges plus complexes que les systèmes modèles, une étude de fractionnement des protéines salivaires a été
entreprise, permettant notamment de d’éliminer l’amylase, protéine majoritaire de la salive humaine. De même,
un fractionnement d’un vin rouge a été entrepris pour disposer de fractions de tannins caractérisées par
spectrométrie de masse.
La sonde peptidique est l’outil moléculaire qui offre le plus de perspectives de développement ultérieur.

Mots clés : spectrométrie de masse, astringence, protéine de la salive, polyphénols, sondes moléculaires.
























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ABSTRACT

Astringency is a pucker or dry mouth sensation, typically experimented with red wine tasting, that finds
its origin in the complexation of polyphenols with salivary proteins, producing a reduced lubrication of the oral
cavity. Among salivary proteins, proline rich proteins (PRPs) are well known for their capacity to bind and
precipitate dietary polyphenols. A better knowledge of this phenomenon at the molecular level is required in order
to master it. A 14 amino acid stretch from the PRP IB7 has been synthesized and shown to be a representative
mimic of PRPs. Previous work by Energy Resolved Mass Spectrometry (ERMS) allowed characterizing the keys
parameters of the interactions between these polyphenols and the IB7 probe. An affinity scale in the gas phase 14
was determined in this way.
However, the ERMS approach was hardly compatible with the complexity of wine polyphenols, and a
validation of the affinity scale in condensed phase was required. Thus, we designed a new strategy relying on the
use of molecular probes immobilized on magnetic beads. A peptidic probe was obtained by grafting the synthetic
IB7 peptide on magnetic beads bearing carboxylate functions, and used to study its interaction with model 14
polyphenols. After magnetic precipitation of the beads, unbound polyphenols left in the supernatant were
quantified by mass spectrometry using an internal standard. An affinity scale in liquid phase was established in
this way. Relative positions of model polyphenols on this latter scale were similar to those determined by ERMS.
A polyphenolic probe was obtained by grafting a model polyphenol on beads bearing amine functions. This probe
has been used to study the interaction with IB7 . 14
To prepare further work on more complex mixtures, attempts were made to fractionate human saliva;
this allowed eliminating amylase, the major salivary protein. Wine tannins were also fractionated, in order to
isolate condensed polyphenols that are characterized by mass spectrometry.
The peptidic probe is the molecular tool that offers the best perspectives for future work.

Key words : mass spectrometry, astringency, salivary proteins, polyphenols, molecular probes.
















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A ma mère, je dédie ce manuscrit



























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Ce travail de thèse a été réalisé grâce au soutien financier du Comité Interprofessionnel des Vins de
Bordeaux, au sein de l’Institut Européen de Chimie et Biologie dans l’équipe du laboratoire de Spectrométrie de
Masse des Macromolécules Biologiques (UMR 5248) sous la direction du professeur Jean-Marie Schmitter. Je
tiens à vous remercier de m’avoir fait confiance pour mener à bien ce projet de recherche, je regretterai juste de
ne pas avoir assez profitée de vos connaissances. Merci de m’avoir accueillie dans votre équipe (deux fois, une
fois en master et en thèse).

Je remercie également tous les membres de mon jury d’avoir acceptés d’évaluer mon travail, et de
trouver le temps nécessaire mon lire mon manuscrit.
Monsieur BOLBACH, j’ai apprécié vos remarques, vos suggestions ainsi que vos idées auxquelles je
n’aurais pas pensé mais qui m’ont permis de découvrir de nouvelles techniques intéressantes.
Monsieur MERILLON cela fut un plaisir d’être évaluée par quelqu’un connaissant le domaine des
polyphénols sous un autre angle.
Monsieur GALLOIS, merci d’avoir accepté d’être mon président de mon jury de thèse, et d’avoir pris le
temps de juger mon travail.
Monsieur LAGUERRE, je n’ai qu’un seul mot MERCI. En plus d’être un membre de mon jury, j’ai eu
l’immense chance de travailler chez vous. Je n’oublierais pas toutes nos conversations sur les polyphénols (qui
datent de l’époque de mon master) et tous vos précieux conseils.

Passons maintenant aux « autres remerciements », je vais certainement oublier des personnes j’espère
qu’elles ne m’en tiendront pas rigueur.
A mon équipe merci de m’avoir accueillie si chaleureusement, d’avoir été présente dans les bons comme dans
les mauvais moments.

Katell…..j’ai adoré cette dernière année à partager ton bureau (pas le lundi). Nos discussions, ton rire
vont me manquer, mais je garderais en souvenir tou