Unusual building blocks and domain organization of non-ribosomal peptide synthetases [Elektronische Ressource] = Ungewöhnliche Synthesebausteine und Domänenorganisation von nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen / vorgelegt von Matthias Strieker

Matthias Strieker

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• Publié par: philipps-universitat_marburg
• Publié le: 01 janvier 2009
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Extrait

Unusual Building Blocks and Domain Organization of  
Non‐Ribosomal Peptide Synthetases 
Ungewöhnliche Synthesebausteine und Domänenorganisation von 
Nicht‐Ribosomalen Peptidsynthetasen 
 
 
 
 
 
Dissertation 
zur 
Erlangung des Doktorgrades 
der Naturwissenschaften 
(Dr. rer. nat.) 
 
 
 
dem 
Fachbereich Chemie 
der Philipps‐Universität Marburg 
vorgelegt von 
 
 
Matthias Strieker 
aus Lingen an der Ems 
 
 
 
Marburg an der Lahn, 2009 
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Vom Fachbereich Chemie 
der Philipps‐Universität Marburg als Dissertation 
am 01.09.2009 angenommen. 
 
Erstgutachter :   Prof. Dr. M. A. Marahiel 
  (Philipps‐Universität Marburg) 
Zweitgutachter :  Prof. Dr. C. T. Walsh  
  (Harvard Medical School, Boston, MA, Vereinigte Staaten von Amerika) 
  
 
Tag der Disputation: 25.09.2009  
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Dedicated to my parents 
in loving memory
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iv  
Abstract 
  
Abstract 
The  diverse  class  of  non‐ribosomal  peptides  consists  of  manifold  pharmacologically 
important natural products. They are clinically used in antibiotic, antiviral and antitumor 
therapy, furthermore some are known immunosuppresants. The biological activity is based 
on their structural diversity, as they contain various non‐proteinogenic building blocks and 
amino acids of which many are  ‐modified. It was shown that the latter are important for 
biological activity, but little is known about their biosynthetic origin. In particular, these 
building  blocks  are  key  determinants  of  the  class  of  acidic  lipopeptide  antibiotics  and 
kutznerides, which are in the focus of this thesis. 
To  determine  the  mechanism  underlying  the  biosynthetic  origin  of  the  synthetically 
challenging  ‐hydroxylated asparagine (hAsn) moieties, found in the acidic lipopeptides CDA 
and A54145, the corresponding recombinant non‐heme iron (II)/ ‐ketoglutarate dependent 
hydroxylases AsnO and LptL have been examined in vitro. Direct hydroxylation of the free 
amino acid was observed in both cases, clearly indicating a precursor synthesis pathway. The 
crystal structure of one of the two hydroxylases (AsnO) was determined at high resolution 
and  revealed  a  substrate  induced  fit  mechanism  of  the  enzyme.  Upon  addition  of 
asparagine, a lid‐like region seals the active site and shields it from sterically demanding 
substrates, which explains the observed specificity for free asparagine. Furthermore, the 
AsnO structure could be seen as an archetype enzyme for non‐heme iron hydroxylases 
acting  on  free  amino  acids.  It  was  possible  to  predict  amino  acid  binding  residues  for 
homologous enzymes by 3D modeling. 
In order to fully understand the mechanisms of  ‐hydroxylated building blocks synthesis, the 
hydroxylases KtzO and KtzP, predicted to be responsible for the generation of the two 3‐
hydroxyglutamic  acid  isomers  found  in  the  mixture  of  antifungal  and  antimicrobial 
kutznerides, were produced recombinantly and analyzed in vitro. Notably, they were found 
to work in trans to the assembly line on PCP‐tethered glutamic acid rather than on the free 
amino acid. Unexpectedly, as the two isomers are found in approximately equal amounts in 
mature kutznerides, KtzO was shown to stereospecifically generate threo‐hydroxyglutamate, 
while KtzP catalyzed the formation of the erythro isomer by co‐elution HPLC experiments 
with synthetic dabsylated standards. A powerful method that employs non‐hydrolyzable 
coenzyme  A  analogs  was  developed,  which  allowed  the  determination  of  the  kinetic 
parameters of enzymes working on PCP‐bound substrates for the first time. Furthermore, a 
hitherto  unknown  mechanism  of  NRPS  assembly  line  restoration  was  observed.  The 
corresponding adenylation (A) domain for glutamic acid activation in the kutzneride NRPS 
was found to be corrupted. Herein, it is shown that this lack of a functional A domain is 
compensated in trans by a stand‐alone A domain. These findings elucidated the mechanism 
for the in trans compensation and the stereospecific hydroxyglutamate generation in detail 
and  may  guide  the  usage  of  in  trans  hydroxylation/compensation  enzymes  in 
biocombinatorial engineering approaches. 
In the third part of this work, the acquired knowledge about the mechanisms underlying 
enzymatic  ‐hydroxylation  of  amino  acids  was  exploited  for  the  synthesis  of  the 
pharmaceutically  relevant  ‐hydroxyaspartate.  Primarily,  this  was  facilitated  by  the 
structure elucidation of AsnO in which the substrate binding residues were identified. By site 
directed mutagenesis, an AsnO variant was generated, which notably did not hydroxylate 
the original substrate asparagine, instead it was found to stereospecifically catalyze the 
formation  of  L‐threo‐hydroxyaspartic  acid,  even  in  commercially  interesting  amounts. 
Therefore, the AsnO variant is an excellent example for the application of basic research in 
order to generate pharmacologically relevant non‐proteinogenic amino acids.      
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Zusammenfassung 
  
Zusammenfassung 
Die  mannigfaltige  Klasse  der  nicht‐ribosomalen  Peptide  beinhaltet  viele  pharmakolisch 
relevante  Wirkstoffe, die in der Klinik in der Antibiotika‐, Krebs‐ und Immunsupp