Cytométrie en flux : principes et applications cliniques

Magali Le Garff-Tavernier, Hélène Merle-Béral

Description

La cytométrie en flux (CMF) est une technique qui permet de caractériser et de quantifier avec précision les cellules normales et pathologiques, même si leur proportion est faible ou minoritaire. En pathologie humaine, elle est principalement utilisée en hématologie où elle constitue une étape essentielle du diagnostic et du suivi des hémopathies malignes, et en immunologie pour l’étude des déficits immunitaires innés ou acquis.PrincipesLa CMF permet d’évaluer simultanément différentes caractéristiques d’une cellule ou d’une particule. Le comptage des cellules par mesure de l’extinction des signaux lumineux lors du passage des cellules circulant dans un tube capillaire devant un détecteur photo-électrique a été conçu en 1934 [6]. Les mesures sont effectuées pendant que ces cellules défilent une à une dans un flux liquidien, devant une ou plusieurs sources lumineuses d’excitation qui sont le plus souvent des lasers. Chaque particule traversant ce faisceau lumineux l’interrompt, ce qui permet de les dénombrer, et elle le diffracte, ce qui fournit des informations sur la nature de la cellule (Figure S4-P1-C3-1a). Le principe de la CMF a été utilisé pour l’automatisation de l’immunophénotypage qui est réalisé par des cytomètres en flux. La technique consiste en la détection et la quantification d’antigènes (Ag) à la surface et dans le cytoplasme ou le noyau de cellules préalablement marquées par des anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes. Deux paramètres sont analysés, apportant des informations sur la taille de la cellule (forward angle scatter, FAS ou FSC) et sur la structure ou granularité cellulaire (right angle scatter, RAS ou SSC). Ces paramètres permettent de réaliser un fenêtrage sur la population cellulaire d’intérêt (Figure S4-P1-C3-1b), puis d’analyser les valeurs de fluorescence spécifiques de chacun des fluorochromes couplés aux anticorps monoclonaux utilisés. Les fluorochromes sont en effet capables d’absorber l’énergie lumineuse provenant du laser, puis de libérer cette énergie, appelée fluorescence, par émission de photons de longueur d’onde supérieure (Figure S4-P1-C3-2). La plupart des laboratoires d’hématologie et d’immunologie utilisent actuellement des cytomètres à six, huit ou dix couleurs. Ce procédé d’analyse multi-paramétrique s’effectue à très grande vitesse, pouvant atteindre plusieurs milliers d’événements par seconde.

Sujets

• Hématologie

Informations

• Publié par: Editions du Traité de Médecine
• Date de parution: 01 janvier 2018
• Nombre de lectures: 1
• Langue: Français

Extrait

1

Hématologie

Chapitre S04P01C03 Cytométrie en flux : principes et applications cliniques

H M B M L G T ÉLÈNE ERLE ÉRAL ET AGALI E ARFF AVERNIER

3 C0  1 0 P 4 S0

3 0 C 01 P 4 S0

La cytométrie en flux (CMF) est une technique qui permet de carac tériser et de quantifier avec précision les cellules normales et patholo giques, même si leur proportion est faible ou minoritaire. En pathologie humaine, elle est principalement utilisée en hématologie où elle constitue une étape essentielle du diagnostic et du suivi des hémo pathies malignes, et en immunologie pour l’étude des déficits immu nitaires innés ou acquis.

Principes

La CMF permet d’évaluer simultanément différentes caractéristiques d’une cellule ou d’une particule. Le comptage des cellules par mesure de l’extinction des signaux lumineux lors du passage des cellules circulant dans un tube capillaire devant un détecteur photoélectrique a été conçu en 1934 [6]. Les mesures sont effectuées pendant que ces cellules défilent une à une dans un flux liquidien, devant une ou plusieurs sources lumineuses d’excitation qui sont le plus souvent des lasers. Chaque particule traversant ce faisceau lumineux l’interrompt, ce qui permet de les dénombrer, et elle le diffracte, ce qui fournit des infor mations sur la nature de la cellule (Figure S04P01C031a). Le principe de la CMF a été utilisé pour l’automatisation de l’immunophé notypage qui est réalisé par des cytomètres en flux. La technique

S04P01C03

Right angle scatter (granularité de la cellule)

consiste en la détection et la quantification d’antigènes (Ag) à la surface et dans le cytoplasme ou le noyau de cellules préalablement marquées par des anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes. Deux paramètres sont analysés, apportant des informations sur la taille de la cellule (forward angle scatter, FAS ou FSC) et sur la structure ou granu larité cellulaire (right angle scatter, RAS ou SSC). Ces paramètres per mettent de réaliser un fenêtrage sur la population cellulaire d’intérêt (Figure S04P01C031b), puis d’analyser les valeurs de fluorescence spécifiques de chacun des fluorochromes couplés aux anticorps mono clonaux utilisés. Les fluorochromes sont en effet capables d’absorber l’énergie lumineuse provenant du laser, puis de libérer cette énergie, appelée fluorescence, par émission de photons de longueur d’onde supérieure (Figure S04P01C032). La plupart des laboratoires d’hématologie et d’immunologie utilisent actuellement des cytomètres à six, huit ou dix couleurs. Ce procédé d’analyse multiparamétrique s’effectue à très grande vitesse, pouvant atteindre plusieurs milliers d’événements par seconde. Les automates d’hématologie cellulaire actuels quantifient les diffé rents éléments figurés du sang en utilisant la CMF. Ils permettent ainsi d’obtenir la numération des globules rouges, des plaquettes, des glo bules blancs après lyse des globules rouges, le dosage de l’hémoglobine par méthode colorimétrique, le calcul de l’hématocrite, de la concen tration en hémoglobine (CCMH) et de la quantité d’hémoglobine par hématie (TCMH). La plupart d’entre eux donnent la formule san guine, avec des alarmes pour diverses situations pathologiques telles que des agrégats plaquettaires, la présence d’érythroblastes ou de cel lules anormales. À côté de ces analyseurs utilisés en routine, il existe des cytomètres trieurs permettant de séparer des populations cellulaires et des cyto mètres pouvant analyser plus de vingt paramètres de fluorescence dont l’usage est actuellement réservé à la recherche. Les anticorps monoclo naux utilisés sont le plus souvent d’origine murine et sont dirigés

00) 1 0 × (

Polynucléaires neutrophiles

Source lumineuse Forward angle (RAS ou SSC) 50 100 150 200 250 excitatrice scatter Right angle scatter (≥ 1 laser) (taille de la cellule) 50 100 150 200 250 (×1,000) Forwardangle scatter (FAS ouFSC) Monocytes Globules rouges, débris cellulaires, plaquettes Lymphocytes a b Figure S04P01C031Informations « morphologiques » apportées par la cytométrie en flux. La CMF permet d’ana lyser deux paramètres indépendants des anticorps monoclonaux : leforward angle scatter(FAS ou FSC), proportionnel à la taille de la cellule, qui correspond à la lumière mesurée dans l’axe de la cellule, et leright angle scatter(RAS ou SSC), proportionnel à la granularité de la cellule, qui correspond à la lumière mesurée à 90° de l’axe de la cellule (a). Ils permettent de réaliser un fenêtrage sur la population leucocytaire à étudier : les lymphocytes, monocytes ou polynu cléaires neutrophiles (b).