Tests génétiques

Alain Verloes

Description

Détection des variants de petite tailleIl n’entre pas dans les objectifs de ce chapitre de décrire en détail les techniques de laboratoire nécessaires à l’analyse de l’ADN à but diagnostique, mais seulement de passer en revue quelques données générales. D’un point de vue très pratique, rappelons ici que la culture de lymphocytes requiert du sang prélevé sur tube hépariné. Toutes les technologies basées sur l’étude de l’ADN (séquençage, analyse chromosomique sur puce ADN [ACPA]) se font à partir de sang prélevé sur tube anti coagulé à l’EDTA (éthylènediaminetétraacétique). La récolte de l’ARN requiert des tubes spécifiques (par exemple : tubes PAXgene® qui assurent sa stabilité).

Informations

• Publié par: Editions du Traité de Médecine
• Date de parution: 01 janvier 2020
• Nombre de lectures: 0
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 4 Mo

Extrait

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Génétique et maladies métaboliques

Chapitre S24P01C04

Tests génétiques

A V LAIN ERLOES

Détection des variants de petite taille

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04 C 1- 0 P 4- S2

Il n’entre pas dans les objectifs de ce chapitre de décrire en détail les techniques de laboratoire nécessaires à l’analyse de l’ADN à but diag- nostique, mais seulement de passer en revue quelques données géné- rales. D’un point de vue très pratique, rappelons ici que la culture de lymphocytes requiert du sang prélevé sur tube hépariné. Toutes les technologies basées sur l’étude de l’ADN (séquençage, analyse chro- mosomique sur puce ADN [ACPA]) se font à partir de sang prélevé sur tube anti coagulé à l’EDTA (éthylènediaminetétraacétique). La récolte de l’ARN requiert des tubes spécifiques (par exemple : tubes PAX-  gene qui assurent sa stabilité).

Amplification de l’ADN par PCR

La réaction en chaîne de la polymérase, ou PCR, est une technique d’amplification d’un fragment d’ADN délimité par deux oligonucléo- tides synthétiques (appelés amorces) complémentaires des bornes du segment que l’on veut étudier. Plusieurs cycles de synthèse/dénatura- tion de l’ADN permettent d’amplifier spécifiquement le segment d’ADN délimité par les deux amorces. La quantité d’ADN nécessaire peut être très réduite : dans le cadre du diagnostic pré-implantatoire, la PCR est faite à partir de l’ADN d’une seule cellule ! Le fragment amplifié peut être analysé par diverses techniques ou servir lui-même de sonde. Des artifices techniques permettent de réaliser simultané- ment plusieurs PCR en parallèle (PCR multiplex). La sensibilité des techniques de PCR les rend très sensibles aux contaminations par les ADN exogènes. Des raffinements méthodologiques permettent d’uti- liser les techniques de PCR de façon quantitative (qPCR) : en compa- rant la quantité d’ADN générée en parallèle pour plusieurs cibles, on peut déduire le nombre de copies d’une séquence d’intérêt dans un génome. La qPCR est notamment utilisée en routine pour vérifier l’existence de CNV (copy number variant) détectés par ACPA. Certaines techniques de détection de mutations font appel à la PCR. Ainsi, on peut réaliser en parallèle deux PCR en positionnant l’une des amorces au niveau d’une mutation récurrente. L’une des PCR utilise une amorce complémentaire de la séquence sauvage, l’autre de la séquence mutée. Si le sujet est homozygote normal, la PCR utilisant l’amorce complémentaire de la mutation échouera ; s’il est homo- zygote muté, seules les amorces complémentaires de la mutation per- mettront l’amplification. Les deux réactions sont possibles chez un hétérozygote. Ce type de réaction (en anglais :amplificationrefractory mutation system[ARMS]) est utilisé pour génotyper rapidement et à faible coût des mutations communes.

Analyse d’une séquence d’ARN

L’ARN est instable. Pour étudier sa séquence, il faut le retranscrire en ADN complémentaire (ADNc) grâce à unereverse-transcriptase.

S24P01C04

L’ADNc peut alors être étudié par les méthodes qualitatives ou quan- titatives utilisées pour l’ADN.

Recherche de mutation par séquençage classique

Fred Sanger, double prix Nobel, a mis au point en 1975 une tech- nique de séquençage de l’ADN qui porte son nom. La méthode a évolué (miniaturisation et utilisation d’un marquage fluorescent au lieu de mar- quage radioactif), mais le principe trouvé par Sanger demeure. La réac- tion de séquençage repose sur la synthèse, nucléotide par nucléotide, du brin complémentaire d’un fragment d’ADN simple brin (typiquement le produit dénaturé d’une réaction de PCR). Le milieu contient les quatre nucléotides classiques et de très petites quantités de quatre didé- soxynucléotides fluorescents. L’incorporation au hasard d’un didésoxy- nucléotide bloque l’élongation du brin complémentaire. Après plusieurs cycles d’élongation, les fragments néosynthétisés sont séparés par électro- phorèse capillaire en fonction de leur longueur. En identifiant la nature du nucléotide fluorescent terminant chaque fragment par un détecteur laser, on peut reconstituer la séquence du fragment d’ADN. L’analyse est automatisée et informatisée. Les séquenceurs récents peuvent analyser en parallèle jusqu’à 96 échantillons. Le séquençage selon Sanger est l’outil le plus communément utilisé pour confirmer un diagnostic génétique. Il faut toutefois en connaître ses limites pratiques : – Ce séquençage n’est pas quantitatif : la méthode ne permet pas de quantifier le nombre de copies de la séquence présente dans l’échantil- lon. Par conséquent, les délétions complètes d’exon (et, plus générale- ment, d’un gène entier) passeront inaperçues. De même, en cas d’échec de l’amplification d’un allèle par PCR (ce qui peut survenir par exemple si le variant est en regard d’une amorce), l’allèle non amplifié ne sera pas analysé : un variant hétérozygote ne sera pas détecté. – Le séquençage d’un gène est limité, en routine, à l’analyse des exons et des jonctions exon-intron, après amplification de chacun d’entre eux par PCR. L’analyse se fait donc exon par exon. La taille maximale d’un fragment séquençable ne dépasse pas 700 à 900 bases. Les grands exons doivent donc être séquencés en plusieurs segments. Les remaniements structurels des exons (inversion, délétion, duplica- tion) ne sont pas détectables. – Les variations introniques à distance des sites donneurs ou accep- teurs et celles des séquences régulatrices ne sont pratiquement jamais investiguées en routine. Pour les maladies dont le mécanisme pathogénique est une perte de fonction, on évalue la sensibilité de la technique à 90 %.

Séquençage de haut débit de nouvelle génération (NGS)

Le NGS représente une révolution technologique. Il repose sur des techniques de séquençage en parallèle utilisant des approches bio- chimiques ou physicochimiques innovantes et très évolutives (que nous ne décrirons pas). Les techniques actuelles de NGS ne permettent de séquencer que de très courts fragments d’ADN (typiquement de moins de 200 pb). Les fragments à séquencer sont générés de façon aléatoire : leurs séquences se chevauchent donc. La source de ces frag- ments est variable : ADN génomique, produits de PCR fragmentés, ADNc… Les fragments d’intérêt couvrant un nombre variable d’exons d’un nombre variable de gènes peuvent être sélectionnés par différentes méthodes (capture par hybridation…). Les kits de capture peuvent