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Claire Dumas

Description

Niveau: Secondaire, Lycée, Première

• exposé

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• micro-organismes par cm?


• cellule


• micro-organisme


• composition ionique de la solution environnante


• adhésion


• rugosité des matériaux


• traitement des surfaces

Sujets

• Première
• SVT
• Exposé
• Cellule
• Micro-organisme
• Adhésion

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• Publié par: profil-mazor-2012
• Nombre de lectures: 31
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

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Chapit re 4 :

Étudedel’adhésiondeGeobacter

sulf urreducens à l’aide d’une cellule

àécoulement

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Ch a p itre 4 : Étu d e d e l’a d h é s io n d eG e o b a c t e r s u lfu r r e d u c e n sd ’u n e c e llu le àà l’a i d e é c o u le m e n t Chapitre 4 :

Étude de l’adhésion de Geobacter sulfurreducens à l’aide d’une

cellule à écoulement

L’objectif de l’étude est de caractériser l’adhésion d’un biofilm électroactif sur une électrode de PACM. Est-ce que l’adhésion d’un tel biofilm est différente de celle d’un biofilm « non- électroactif » ? Est-ce que l’adhésion est similaire lorsque le biofilm est formé sous polarisation anodique et cathodique? Est-ce que les écarts de densité de courant obtenus sur les différents matériaux peuvent être expliqués par des différences d’adhésion des bactéries sur les électrodes? La première section présente les différents paramètres qui influencent l’adhésion microbienne au

niveau du support et du micro-organisme. La deuxième section expose les différentes cellules à écoulement utilisées dans la bibliographie afin d’étudier l’adhésion ou le détachement de micro- organismes. Par la suite, les propriétés de surface des matériaux sont présentées. Tout d’abord, les mesures de la rugosité des matériaux étudiés sont rappelées ainsi que l’influence de la rugosité du support sur la production de courant. L’influence de la rugosité du support sur l’adhésion des micro-organismes est abordée grâce à l’étude de l’adhésion d’un biofilm deG. sulfurreducensformé en réduction sur de l’acier inoxydable modifié par un traitement de surface visant à augmenter sa rugosité. En effet, l’acier inoxydable a conduit à des densités de courant très élevées lorsque le biofilm était formé sous polarisation cathodique (paragraphe 4 du chapitre 3). Le but est d’augmenter la surface active, c'est-à-dire la surface colonisée par des micro-organismes par cm² de surface géométrique, en vue d’une augmentation de la production de courant. La caractérisation des matériaux se poursuit par des tests de dépôts de goutte sur support afin de déterminer le caractère hydrophile/hydrophobe des matériaux. Enfin, la dernière section présente les résultats de détachement effectués dans la cellule à écoulement cisaillé.

1.Paramètres qui influencent l’adhésion des bactéries “No surfaces have been found that are exempt from biofouling. Surface structure does appear to influence the rate of fouling, but only initially over the first few hours of exposure. In general, smooth surfaces foul at a slower initial rate than do rough ones, but biofilm formation after a period of days is inevitable” (Meltzer 1993) Il est important de noter, que les paramètres qui vont être présentés jouent un rôle important au cours de l’adhésion primaire du micro-organisme, c'est-à-dire au cours de la première phase de l’adhésion des micro-organismes lors de la formation d’un biofilm.

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Ch a p itre 4 : Étu d e d e l’a d h é s io n d es u lfu r r e d u c e n sG e o b a c t e r à l’a i d e d ’u n e c e llu le à é c o u le m e n t

1.1.Facteurs pouvant modifier l’adhésion : influence du matériau La charge de surface et le caractère hydrophobe des matériaux La charge à la surface d’un solide peut engendrer des forces électrostatiques d’attraction ou de répulsion lors de l’approche de la bactérie. Les cellules bactériennes possèdent une charge négative sur leur membrane cellulaire (Corpe 1970) mais cette charge est plus ou moins importante d’une souche à l’autre. La charge de surface du matériau peut être modifiée par le pH et la composition ionique de la solution environnante. Selon Lerebour, rendre la surface d’un matériau hydrophobe et apolaire pourrait réduire l’adhésion microbienne et les liens adhésifs

entre le micro-organisme et le matériau (Lerebour et al. 2004). Cependant la charge de surface

peut aussi être modifiée par l’adsorption de protéines, qui a lieu au cours des premières étapes de l’adhésion. Cette adsorption augmente avec l’hydrophobicité du support (Nath et al. 2004; Pamula et al. 2004) ; Le nettoyage des surfaces Les traitements de nettoyage des surfaces influencent la charge et l’énergie de surface du matériau (Boulangé-Petermann 1997)(Boulangé-Petermann 1996). Selon les produits utilisés pour le nettoyage des surfaces (produits acides, basiques, …), les surfaces peuvent être plus ou moins

chargées et posséder des énergies de surface différentes, engendrant ainsi une adhésion différente du micro-organisme. Le nettoyage de l’acier avec un mélange HF/HNO dissout la couche 3 d’oxydes du matériau. Dès que le matériau est exposé à l’air, il se recouvre à nouveau d’oxydes. Selon le temps d’exposition à l’air, la couche d’oxydes ne possède pas les mêmes propriétés (par

exemple d’hydrophilie, paragraphe 3.2) et peut donc influencer l’adhésion. La rugosité des matériaux Comme cela a été présenté dans le chapitre 3, la rugosité semble jouer un rôle important dans

l’adhésion bactérienne et dans notre cas, dans la production de courant. L’influence de la rugosité

du support reste tout de même un paramètre très discuté dans la littérature. Des chercheurs suédois ont comparé le développement de biofilms sur des échantillons d’acier inoxydable présentant différents états de surface, exposés à de l'eau potable municipale (Pedersen 1990). Après 167 jours, ils constatent qu’un acier inoxydable mat rugueux était 1,4 fois plus recouvert de micro-organismes que l’acier électropoli. Selon les auteurs, des surfaces rugueuses: i)

possèdent une surface active plus importante, ii) protègent les cellules des forces de cisaillement

dues à l’écoulement. En revanche, pour d’autres auteurs, la rugosité permet de réduire la surface

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Ch a p itre 4 : Étu d e d e l’a d h é s io n d eG e o b a c t e r s u lfu r r e d u c e n sc e llu le àà l’a i d e d ’u n e é c o u le m e n t de contact entre le micro-organisme et le support, favorisant ainsi son détachement (Boulangé-

Petermann 1997). Ainsi, la rugosité des supports ne parait pas influencer directement l’adhésion.

Certains auteurs rapportent que la rugosité des matériaux influence l’adhésion au-dessus d’une valeur de rugosité moyenne de 0,9µm (Hilbert et al. 2003). D’autres auteurs affirment qu’au- dessus de 10 µm (Scheuerman et al. 1998), la rugosité n’a plus d’influence sur l’adhésion. Il apparaît alors que pour que la rugosité influence l’adhésion des micro-organismes, la valeur de la rugosité moyenne du support doit être de l’ordre de grandeur du diamètre de l’élément biologique

étudié. Du fait de la variabilité des diamètres des espèces étudiées ainsi que des gammes de rugosité étudiées, des supports utilisés, et des méthodes d’évaluation de l’adhésion, il est difficile de

conclure rapidement quant à l’effet de la rugosité sur l’adhésion. L’étude doit être réalisée au cas par cas. 1.2.Paramètres influençant l’adhésion : influence de la cellule bactérienne De nombreux facteurs cellulaires peuvent modifier l’adhésion cellulaire sur des surfaces de matériau. Parmi ceux-ci, certains sont liés à la physiologie du micro-organisme lui-même, la présence d’appendices (pili, flagelle…), le mode de culture, le temps de contact avec le support et

la composition du milieu de suspension. Caractère hydrophile/hydrophobe de la surface des cellules L’hydrophobicité globale d’un micro-organisme peut être mesurée à l’aide de la technique MATS (Microbial Adhesion To Solvents (Bellon-Fontaine et al. 1996)). La bactérieG. sulfurreducens, présentée dans cette étude, est une bactérie Gram - . La paroi des bactéries Gram - constituée de peptidoglycane recouvert d’une membrane externe dans est laquelle sont insérés des lipoprotéines, des LipoPolySaccharides (LPS) et des trimères : c’est un

réseau lâche et plus mince que la membrane des bactéries Gram+ (Figure 61). Les parois des bactéries Gram -  possèdent également davantage d’acides aminés et de lipides. Les bactéries Gram- sont généralement plutôt hydrophiles cependant les protéines de surface présentes sur

leur paroi peuvent les rendre hydrophobes.

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Ch a p itre 4 : Étu d e d e l’a d h é s io n d eG e o b a c t e r s u lfu r r e d u c e n sc e llu le ài d e d ’u n e à l’a é c o u le m e n t

Figure 61 :Schéma de la composition des parois des bactéries Gram - 11 Il a été démontré que cette caractéristique du micro-organisme se révèle importante du point de

vue de l’adhésion. Pradier et al. ont récemment montré que, parmi trois souches de bactéries marines Gram-, la souche dont la surface est la plus riche en protéines adhère deux fois plus à l’acier mais aussi au

verre et au téflon que les autres souches (Pradier et al. 2005). Faille et al. ont démontré, par exemple, que le nombre de spores hydrophobes adhérées sur différents supports (PVC, verre, acier inoxydable) deBacillus cereusétait dix fois plus élevés que celui des spores hydrophiles de

Bacillus subtilis(Faille et al. 2002).De plus, lesB.cereusétaient plus résistants que lesB.subtilisaux

12 procédures de nettoyage . À notre connaissance aucune étude d’hydrophobicité MATS ou équivalentes n’existe sur la soucheGeobacter sulfurreducens. 13 La présence d’appendices (pili, flagelles ) ou de substances polymériques extra-

cellulaires

La résistance des biofilms, en terme de force d’adhérence, peut être due à la présence d’appendices. Plusieurs auteurs indiquent que la présence de flagelles et la mobilité des bactéries

favorisent les premières étapes de formation du biofilm (Gavin et al. 2003; Lejeune 2003; Moreira

11 http://microbiologie.spectrosciences.com/print.php?mod=3 (i) 5 min rinçage avec de l'eau adoucieà une vitesse moyenne d'écoulement de0,5 m.s , (ii) 10 min nettoyage avec 12 –1 –1 un détergent alcalinGalor 7/32 (Penngar, France) 1% à 50°C à une vitesse moyenne de, et (1,0 m s iii) 5 min rinçage avec de l'eau adoucie à une vitesse moyenne d'écoulement de.0,5 m s –1 13 Les flagelles sont des appendices qui servent à la mobilité des bactéries. Les pilis en revanche peuvent se retrouver sur des bactéries non motiles, ce sont de simples appendices qui servent par exemple à l’agrégation ou le contact « électrique » comme par exemple lesnanowiresdeG. sulfurreducens.

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Ch a p itre 4 : Étu d e d e l’a d h é s io n d eG e o b a c t e r s u lfu r r e d u c e n sà l’a c e llu le ài d e d ’u n e é c o u le m e n t et al. 2003). Les flagelles peuvent, en effet, faciliter le contact avec le support en permettant de franchir la zone de répulsion électrostatique (Herald et al. 1988). Ceci favorise l’adhésion des cellules directement en contact avec la surface. Les pilis jouent également un rôle primordial dans

l’adhésion et/ou l’autoaggrégation des micro-organismes (Bieber et al. 1998), les bactéries n’ayant pas de pilis adhérent moins facilement que les autres (Fletcher et al. 1993). Le rôle des appendices dans l’adhésion explique pourquoi certaines cellules qui possèdent des propriétés de surface

différentes peuvent coloniser le même type de support. Reguera et al. montrent que les pilis sont

nécessaires à l’agrégation des cellules deG.sulffurreducenset ont un rôle structurel dans la formation

du biofilm (Reguera et al. 2007). Le mode et le milieu de culture

Le mode de culture est une caractéristique importante qui peut modifier fortement l’adhésion des

organismes. Il a été démontré que la température de croissance avait un effet significatif sur la

mobilité électrophorétique cellulaire et la production de flagelles (Briandet et al. 1999) et, ainsi sur l’adhésion. La surface de la bactérie, et donc son caractère hydrophobe peuvent être affectés par la température de croissance (Briandet et al. 1999), l’aération du milieu de culture(Aguilar- Uscanga et al. 2003), la vitesse de rotation lors des centrifugations. De même, la composition du milieu de culture reste aussi un paramètre important. La force ionique est souvent présentée comme un paramètre qui influence l’adhésion (Fletcher 1988). Cependant certains auteurs ne

trouvent aucune influence de la force ionique sur l’adhésion de levures sur du verre pour des concentrations de 33, 150 et 330 mM (Mercier-Bonin et al. 2004b). Au cours de notre étude le milieu et le mode de culture sont des paramètres maintenus constants.

Le temps de contact entre le micro-organisme et son support

Le temps de contact entre le micro-organisme et son support est également très important et joue

sur l’adhésion. Ainsi, certains auteurs ont pu mettre en évidence que des levures étaient plus résistantes à l’écoulement (se détachaient plus difficilement) sur une plaque de verre après un temps de contact de 15h que de 1h (Mercier-Bonin et al. 2004b). Après un temps d’incubation

plus long (15 à 180 minutes), le nombre de bactéries adhérées s’est aussi révélé plus important

(Fletcher et al. 1993).

Les expériences présentées dans le paragraphe 4, ont pour but de tester le détachement de biofilm deG. sulfurreducensles conditions habituelles de croissance sous polarisation, dans conditions dans lesquelles du courant est détecté. Le paramètre déterminant le début de

l’expérience de détachement (et donc la fin du temps de contact) est lorsque le courant détecté

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Ch a p itre 4 : Étu d e d e l’a d h é s io n d eG e o b a c t e r s u lfu r r e d u c e n sà l’a i d e d ’u n e c e llu le à é c o u le m e n t sur l’électrode est stable. Ces mesures de détachement permettront de déterminer les caractéristiques de l’adhésion du biofilm mature deG. sulfurreducenssur différents supports. L’adhésion des micro-organismes dépend donc des propriétés des deux entités, à savoir le support et la bactérie, sans oublier le milieu environnant. Il faut noter cependant que le support peut être modifié assez rapidement. En effet, lorsqu’il est placé dans un environnement aqueux contenant des molécules organiques, ces dernières viennent contaminer la surface du support et

ainsi modifier les propriétés physicochimiques. De même, les propriétés de surface des bactéries

peuvent évoluer avec l’âge de la culture. Notre travail s’est inscrit dans une approche globale puisque l’intérêt s’est préférentiellement porté sur l’étude de l’adhésion d’un biofilm deG. sulfurreducensde plusieurs jours. La plupart des

conditions expérimentales ont été fixées en vue d’une reproductibilité des manipulations: croissance de bactéries à 30°C dans des milieux de cultures identiques, prétraitement des matériaux bien contrôlé… Les seuls paramètres modifiés étant les matériaux sur lesquels

l’adhésion est étudiée, l’âge de l’inoculum et du biofilm. 2.Les différentes cellules à écoulement cisaillé Une cellule à écoulement est un dispositif souvent utilisé afin d’étudier l’adhésion bactérienne ou d’éléments biologiques comme des levures. Le principe de fonctionnement consiste à appliquer un écoulement entre deux plaques planes, distantes de quelques dizièmes de millimètre. L’écoulement au sein de la canalisation doit être laminaire ainsi les lois de la mécanique des fluides sont applicables et les perturbations d’écoulement (comme les tourbillons) sont absentes.

La cellule à écoulement est un dispositif permettant d’étudier soit l’adhésion des bactéries, ou autres éléments biologiques à un support, soit le détachement de ces micro-organismes sur ce même support. Elle peut aussi être utilisée pour l’étude du détachement de particules non

biologiques sur un support afin de tester la nettoyabilité (aptitude au nettoyage) des matériaux.

En général, le fluide utilisé pour le détachement des éléments est de l’eau additionnée ou non de détergents, car les études sont souvent effectuées pour proposer des procédures de détachement afin de lutter contre les micro-organismes (souvent pathogènes commeLegionella)dans les circuits de refroidissement des industries ou les climatisations des hôpitaux, par exemple. L’écoulement peut être soit parallèle au support sur lequel l’adhésion ou le détachement a lieu, soit radial, c’est-

à-dire que l’écoulement arrive perpendiculairement au support par un orifice circulaire (Detrya et al. 2007). La cellule à écoulement est souvent fixée sur le plateau d’un microscope à contraste de phase inversée afin d’observer l’attachement des bactériesin situ.

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Ch a p itre 4 : Étu d e d e l’a d h é s io n d eG e o b a c t e r s u lfu r r e d u c e n sàc e llu le i d e d ’u n e à l’a é c o u le m e n t Une cellule à écoulement a permis d’étudier la co-adhésion de deux types de micro-organismes, c'est-à-dire l’adhésion entre des micro-organismes déjà adhérés sur une surface et d’autres micro-

organismes planctoniques (Bos R. et al.). Le rôle des propriétés structurales et physico-chimiques de la surface des cellules dans cette co-adhésion a été étudié. Les vitesses locales de dépôts des Streptococci qui co-adhérent auxActinomyces déjà adhérées au support se sont révélées beaucoup

plus élevées que celles calculées sur les bases de la convection-diffusion de l’écoulement. En effet, lesStreptococci avancent dans le flux jusqu’auxActinomyces. Leur vitesse vient donc s’ajouter à la vitesse locale de l’écoulement. L’adhésion dePseudomonas aeruginosa a été étudiée par certains auteurs sur du verre recouvert de xerogel capable de relarguer ou non du monoxyde d’azote (Hetrick et al. 2007). Les auteurs montrent que l’utilisation de xerogels relarguant du monoxyde d’azote inhibe l’adhésion et tue les

cellules adhérées.

Certains auteurs se sont aussi intéressés à l’influence des flagelles sur l’adhésion des bactéries Escherichia colidu verre, en utilisant des bactéries motiles (avec des flagelles) et non motiles sur

(avec des flagelles paralysés ou sans flagelles) (McClaine et al. 2002). L’étude se focalise sur des

mesures de taux d’attachement des bactéries et sur la fraction retenue sur la surface du support.

Pour de faibles débits (0,2mL/min), aucune différence n’est observée entre les deux types de bactéries. En revanche lorsque le débit augmente, les bactéries non motiles se détachent plus facilement et les motiles adhèrent davantage. Selon les auteurs, les flagelles permettent aux bactéries de se détacher aux faibles vitesses et renforcent l’adhésion à des vitesses de fluides plus importantes, alors que les bactéries non motiles se détachent sous l’effet du cisaillement crée par

l’écoulement. D’autres études s’intéressent au nettoyage de surfaces solides (verre, acier inoxydable, polystyrène

et polytetrafluoroethylène PTFE) à l’aide d’une cellule à écoulement radial (Detrya et al. 2007). Pour cela, des gouttes d’huile sont déposées puis détachées du support, l’étude est effectuée à l’aide d’une solution contenant un détergent. Le verre apparaît comme le matériau le plus facilement nettoyable, puisqu’une simple immersion dans la solution de nettoyage permet d’éliminer la plus grande partie de l’huile du support. Sur les autres matériaux, l’action mécanique

du flux joue un rôle important. La cellule à écoulement a aussi été adaptée à un écoulement d’air. Des particules de polystyrène

en suspension dans de l’eau sont déposées sur du quartz et du verre. Par la suite des bulles d’air

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Ch a p itre 4 : Étu d e d e l’a d h é s io n d es u lfu r r e d u c e n sG e o b a c t e r d ’u n e i d e à l’a àc e llu le é c o u le m e n t sont injectées dans la cellule afin d’étudier le détachement des particules en polystyrène, hydrophobes (Gomez-Suarez et al. 2001) et en particulier l’influence de la taille des particules et

de la vitesse de la bulle d’air sur le détachement. Il apparaît que des particules de diamètre faibles

(806nm) sont moins sensibles à la vitesse de la bulle d’air que celles de diamètre plus élevé (1400nm). Cependant les particules de diamètre plus important sont moins affectées aux variations de la tension interfaciale liquide-air que les petites particules. Busalmen et al. ont mis en place un système intéressant de cellule à écoulement dans lequel un flux continu de solution bactérienne circule, une électrode de travail en or, une contre électrode en platine et une électrode de référence sont placées au centre de la cellule à écoulement, sous le

microscope. Ce dispositif permet de faire adhérer des bactéries dePseudomonas fluorescens sous

polarisation électrochimique et ainsi d’observer quelle est l’influence du potentiel imposé sur la

structure du biofilm. En effectuant des mesures d’épaisseurs de biofilm et de taux de recouvrementin situ, par contraste de phase, ils montrent que le biofilm formé à +0,50 V vs. Ag/AgCl est de type pyramidal et que les cellules filles sont plus courtes que les mères. Le

biofilm formé à -0,20 V vs Ag/AgCl possède des structures de types « champignons », et les cellules filles sont plus longues. Les auteurs font un rapprochement entre la valeur du potentiel imposé et la concentration du milieu en nutriments. En effet, il avait été montré par James, que lorsque le milieu est riche, le biofilm est étalé, et réparti sur toute la surface (James et al. 1995) comme c’est le cas à -0,20 V vs Ag/AgCl. En revanche, lorsque le milieu est appauvri, le biofilm

s’agrège et est composé de microcolonies comme c’est le cas à +0,50 V vs Ag/AgCl. Le détachement de levures sur acier inoxydable a été étudié à l’aide d’une cellule à écoulement

parallèle (Mercier-Bonin et al. 2004a; Guillemot et al. 2006), ou bien radial (Demilly et al. 2006).

Dans le premier cas, l’observation de l’attachement et du détachement des levures se faitin situ

(par contraste de phase). Dans la seconde étude, les observations au microscope sont effectuées

suite aux tests de détachement, après coloration à l’acridine orange. Demilly et al. montrent que le détachement des levures est facilité sur un acier avec des surfaces gravées aux joints de grains par rapport à un acier poli miroir. De plus, quelle que soit la topographie du support, le détachement

a lieu au-dessus d’un certain seuil. L’efficacité du détachement, défini par le taux de cisaillement pour lequel la moitié des cellules sont arrachées, est indépendante de la topographie. En 14 revanche, la vitesse de détachement des bactéries dépend de la topographie. Les auteurs proposent les étapes de détachement suivantes : une séquence de pelage, de glissement,

14 le nombre de bactéries par cm² est mesuré à différents temps, au cours du détachement en cellule à coulement. Le nombre de cellules détachées entre deux temps de mesures est obtenu par différence; la vitesse de détachement est ainsi calculée en ramenant le nombre de cellules détachées par unité de temps.

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