Molecular analysis of insulin signaling mechanisms in Echinococcus multilocularis and their role in the host parasite interaction in the alveolar echinococcosis [Elektronische Ressource] / vorgelegt von: Christian Konrad

Christian Morgenstern

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• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 106
• Langue: Deutsch
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Extrait

Molecular analysis of insulin signaling mechanisms in
Echinococcus multilocularis and their role in the host-parasite
interaction in the alveolar echinococcosis



Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades der
Bayerischen Julius-Maximilians-Universität
Würzburg


Vorgelegt von:
Christian Konrad
aus Würzburg


Würzburg, Februar 2007




Eingereicht am:

Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender: Prof. Dr. Martin J. Müller
Gutachter: Prof. Dr. Matthias Frosch
Gutachter: Prof. Dr. Jürgen Kreft

Promotionskolloquium am:

Promotionsurkunde ausgehändigt am:


Ehrenwörtliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, die vorliegende Dissertation selbstständig angefertigt
und nur die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet zu haben.
Diese Arbeit ist bisher in gleicher oder ähnlicher Form keinem anderen
Prüfungsverfahren mit dem Ziel der Erlangung eines akademischen
Grades vorgelegen, auch in anderen Fakultäten erfolgte noch keine
vollständige oder teilweise Vorlegung.


Zürich, den 21.2.2007


Christian Konrad

Vielen Dank an……..

Prof. Dr. Matthias Frosch für die Möglichkeit der Promotion, die Übernahme des
Gutachtens und die langjährige Unterstützung, die diese Promotion erst ermöglicht
hat.
Prof. Dr. Jürgen Kreft für die wiederholte Bereitschaft als Gutachter aus der Fakultät
für Biologie zur Verfügung zu stehen.
Prof. Dr. Klaus Brehm für die permanente Unterstützung und die vielen hilfreichen
Diskussionen am Abend, die sehr zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Ich
werde nie das „ Bist Du dir da sicher?“ oder „Wo ist denn die Kontrolle?“ vergessen.
Auch weiß ich jetzt, wen ich bei „Wer Wird Millionär“ mit dem Telefonjoker anrufen
würde und welches fränkische Wort doch mit einem „harden D“ geschrieben wird.
Moni Bergmann, der Protein-Fee, für das erfolgreiche Bewerben des Bio-RAD
Systems und das stets offene Ohr bei Problemen aller Art.
Meiner Bench-Nachbarin Verena für ihre Hilfsbereitschaft und dem einen oder
anderen Schwank. Ich gebe zu, Saarländer sind keine Pfälzer, aber fast….
Markus für die Metazestoden und die Einführung in deren Kultivierung. Ich danke Dir
auch für die schönen Abende mit den Zerglingen, denen das Vespingas ausging….
Katja, Tina, Sabrina S., Florian, Ricardo und Julia für die schöne Zeit.
Bianca bzw. Calvin & Hobbes für die Aufmunterung als die EmMPK-1 mir Kummer
bereitete und diverse Motivationsschübe zum Schreiben dieser Arbeit.
Dr. Alexandra Schubert-Unkmeir für die Möglichkeit an Neisserien zu arbeiten, die
Zeit um diese Doktorarbeit zu schreiben und die fortlaufende Unterstützung.
Sabrina H. für sämtliche Blots von HBMEC-Zellen, auch wenn ich mir ziemlich sicher
bin, dass sie dich im Schlaf verfolgen werden.
Giuseppe für die sizilianische Pizza.
Meiner Familie, die mich immer unterstützte.
Samuel, der mir seit über 10 Jahren ein sehr guter Freund ist.


Contents I
Contents

1 Abstract/ Zusammenfassung 1

2 Introduction 5
2.1 The small fox-tapeworm Echinococcus multilocularis 5
2.1.1 Phylogeny 5

2.1.2 Life cycle 7

2.1.3 E. multilocularis – the causative agent of the alveolar echinococcosis 10

2.1.4 Epidemiology of the alveolar echinococcosis 11

2.2 Insulin/ Insulin-like-Growth-Factor I signaling 12
2.2.1 Hormones of the insulin superfamily 12
2.2.2 Insulin/ IGF-I signaling cascade in mammalian (human) cells 14
2.2.3 Insulin/ IGF-I signaling cascade in invertebrates 18
2.2.4 Insulin/ IGF-I signaling in E. multilocularis 20

2.3 Src-family kinases (non-receptor tyrosine kinases) and GAP-proteins 22

2.4 Molecular biology of E. multilocularis 23
2.4.1 E. multilocularis orthologs of mammalian signaling molecules 23
2.4.2 In vitro cultivation of E. multilocularis larval stages 24
2.4.3 Trans-splicing in E. multilocularis 25
2.4.4 Recombinant antigens 25

2.5 Aims 26







Contents II
3 Results 27

3.1 Insulin promotes growth and survival of E. multilocularis
metacestode vesicles in vitro 27

3.1.1 Insulin promotes growth and survival of E. multilocularis
metacestode vesicles under axenic conditions 27

3.1.2 Immortal hepatocyte cell lines express insulin 28
3.1.3 Host albumin promotes survival of E. mutilocularis metacestode
vesicles in vitro 29


3.2 Insulin and IGF-I affect E. multilocularis metacestode vesicles
on several levels 31

3.2.1 Insulin and IGF-I stimulate DNA de novo synthesis in
E. multilocularis metacestode vesicles in vitro 31

3.2.2 Insulin and IGF-I induce protein phosphorylation in
E. multilocularis metacestode vesicles in vitro 32

3.2.3 Host derived factors including Insulin and IGF-I activate a specific
signal transduction pathway in E. multilocularis metacestode
vesicles in vitro 33

3.2.4 Insulin stimulates egfd expression in E. multilocularis metacestode
vesicles in vitro 37


3.3 EmIR - the E. multilocuaris insulin receptor ortholog as potential 39
transmitter of external signals

3.3.1 Southern blot analysis of E. multilocularis chromosomal DNA – EmIR is
encoded by a single copy gene 39

3.3.2 Production of polyclonal antibodies directed against EmIR´s ligand
binding and intracellular domain 41

3.3.3 Western blot analysis of E. multilocularis metacestode vesicles for the
expression of EmIR 46
Contents III
3.3.4 Expression of EmIR in E. multilocularis larval stages under different
growth conditions 49

3.3.4.1 in vitro activation of protoscolices affects the expression of EmIR 49
3.3.4.2 Expression of EmIR in E. multilocularis metacestode vesicles is
upregulated by host derived factors 53

3.3.5 Immunohistochemical and electron microscopical analysis of the
expression of EmIR in E. multilocularis larval stages 56

3.3.6 Expression of EmIR in a heterologous system 59

3.3.7 in vitro autophosphorylation of insulin stimulated EmIR 64

3.3.8 activation of EmIR in E. multilocularis metacestode vesicles by insulin 66

3.3.9 An inhibitor of human IR tyrosine kinase affects E. multilocularis
metacestode vesicles in vitro 66


3.4 Insulin but not IGF-I can be detected in the hydatid fluid of
E. multilocularis metacestode vesicles in vitro and in vivo 71

3.5 Protein de novo synthesis in E. multilocularis metacestode vesicles is
upregulated by host derived factors different from insulin 76

3.6 Downstream signaling of EmIR in E. multilocularis larval stages 78

3.6.1 Expression of EmIR tyrosine kinase domain in a
heterologous system 78

3.6.2 Identification of IR Orthologs in other Cestodes 81

3.6.2.1 Characterization of cDNAs from distinct cestodes encoding
ligand binding and tyrosine kinase domain of IR orthologs 82

3.6.2.2 Amino acid sequence comparison of the IR ligand binding
and tyrosine kinase domain of cestode IR orthologs 96



Contents IV
3.6.3 Identification of a possible EmIR downstream signaling
cascade in E. multilocularis larval stages 102

3.6.3.1 Analysis of emrhogap cDNA 103
3.6.3.2 Structural features of EmRhoGAP 106
3.6.3.3 Analysis of emfyn cDNA 112
3.6.3.4 Structural features of EmFyn 115
3.6.3.5 Analysis of the expression of emfyn and emrhogap in
E. multilocularis larval stages 123
3.6.3. 6 Analysis of the expression of emfyn and emrhogap in insulin
stimulated E. multilocularis metacestode vesicles 124
3.6.3.7 Interaction between EmFyn and EmIR in vitro 125
3.6.3.8 EmFyn and EmRhoGAP interact in the Yeast Two Hybrid 128
3.6.3.9 EmRhoGAP interacts with EmRap2 and EmRaf in the Yeast
Two Hybrid 130
3.6.3.10 Src-family kinase inhibitors affect E. multilocularis
metacestode vesicles in vitro 132

4 Discussion 134
5 Materials and Methods 142
5.1 Equipment 142
5.2 Consuming articles 142
5.3 Enzymes, commercial kits, chemicals and ol