Participation du fructose 1,6-biphosphate dans l induction de l effet Crabtree chez la levure Saccharomyces cerevisiae, Participacio de la fructosa 1,6-bifosfato en la induccion del efecto Crabtree en la levadura Saccharomyces cerevisiae
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Participation du fructose 1,6-biphosphate dans l'induction de l'effet Crabtree chez la levure Saccharomyces cerevisiae, Participacio de la fructosa 1,6-bifosfato en la induccion del efecto Crabtree en la levadura Saccharomyces cerevisiae

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Description

Sous la direction de Michel Rigoulet, Salvador Uribe Carvajal
Thèse soutenue le 09 février 2010: Bordeaux 2
Lorsque la levure Saccharomyces cerevisiae pousse en aérobiose, la respiration est immédiatement réprimée après l’addition de glucose au milieu de culture. Ce phénomène est appellé ”l’effet Crabtree”. Il a été rapporté que l’inhibition du flux respiratoire est concomitant avec l’accumulation cytoplasmique des hexoses phosphates provenant de la glycolyse. Dans ce travail, la levure Saccharomyces cerevisiae a été utilisée pour chercher à identifier les événements regulatoires à court terme qui sont associés à l’effet Crabtree ainsi que le possible rôle des hexoses phosphates dans l’inhibition de la respiration. En utilisant des mitochondries isolées il a été trouvé que le glucose 6-phosphate et le fructose 6-phosphate stimulent le flux respiratoire. Cet effet est compensé par des niveaux physiologiques de fructose 1,6-biphosphate, lequel inhibe la respiration en absence des autres hexoses phosphates. Cet effet est aussi observé in situ puisqu’il est obtenu en utiisant des sphéroplastes perméabilisés de levure. La répression du flux respiratoire induite par le fructose 1,6-biphosphate est due à une inhibition de l’activité des complexes respiratoires III et IV. Les résultats suggérent que le fructose 1,6-biphosphate pourrait être un des inducteurs de l’effet Crabtree chez la levure. Il est également possible que aussi chez les cellules mammifières cet hexose phosphate puisse réguler le metabolisme des tumeurs, où l’effet Crabtree a aussi été observé.
-Mitochondrie
-Levure
-Glycolyse
-Effet Crabtree
-Sphéroplastes
-Saccharomyces cerevisiae
-Respiration
-Fructose 16-biphosphate
When the yeast Saccharomyces cerevisiae grows aerobically, its respiration is immediately repressed when adding glucose to the culture media. This phenomenon has been termed ”the Crabtree effect”. It has been reported that the respiratory flux inhibition is concomitant with the cytoplasmic accumulation of the glycolysis-derived hexoses phosphates. In this work, S. cerevisiae was used to investigate the short-term regulatory events associated to the Crabtree effect and the role of the hexoses phosphates during the respiratory inhibition. Using yeast isolated mitochondria it was found that glucose 6-phosphate and fructose 6-phosphate stimulate the respiratory flux. This was counteracted by physiological concentrations of fructose 1,6-biphosphate, which also inhibits respiration in the absence of the other two hexoses phosphate. This occurs in situ, as the effect mediated by the fructose biphosphate was also observed in yeast permeabilized spheroplasts. The respiratory flux repression mediated by fructose 1,6-biphosphate is due to an inhibition of the activity of respiratory complexes III and IV. The results suggest that fructose 1,6-biphosphate could be one of the Crabtree effect inducers in yeast. In mammals, this hexose phosphate might regulate as well tumour cell metabolism, where the Crabtree effect has also been observed.
Source: http://www.theses.fr/2010BOR21720/document

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Langue Español
Poids de l'ouvrage 2 Mo

Exrait




Universidad Nacional Autónoma de México

Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas





“Participación de la fructosa 1,6-bifosfato en la inducción del efecto Crabtree en la
levadura Saccharomyces cerevisiae”



TESIS

Que para obtener el grado de doctor en ciencias presenta el:
QFB Rodrigo Antonio Díaz Ruiz




Tutor: Dr. Salvador Uribe Carvajal

























Agradecimientos.

A la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Al programa de doctorado en
ciencias biomédicas (PDCB). Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). A
EGIDE. A la Universidad de Bordeaux-2 y al Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires
(IBGC).

A mis tutores: el Dr. Michel Rigoulet y el Dr. Salvador Uribe. A mi comité tutoral: el Dr.
Alejandro Zentella y la Dra. Rosario Muñoz.

A las personas del IBGC de Burdeos (Francia): Stéphen Manon, Anne Devin, Nicole Avéret,
Patrick Paumard y Mariam Marsan.

A las personas que me han apoyado en el Instituto de Fisiología Celular: el Dr. Antonio Peña, el
Dr. Roberto Coria, Victoriano Pérez, Norma Sánchez, Marta Calahorra, Laura Kawasaki, Sara
Noguera, Rocío Romualdo y al departamento de cómputo.

A quienes que me brindaron apoyo técnico durante mi doctorado: Ramón Méndez, Andrés Rojas,
Gisela Ruiz y Odile Bunoust.

A mi familia: Rosa María, José Antonio, Emma, Ludwig y a toda la familia Ruiz.

A mis amigos y compañeros de laboratorio: Rocío Navarro, Daniela Araiza, Zahuiti Hernández,
Luis Luévano, Manuel Gutiérrez, Alfredo Cabrera, Sergio Guerrero, Arnaud Mourier, Cyrille
Chevtzoff, Cristian Cárdenas, Edith Sánchez, Miriam Rodríguez, Nancy Velázquez, Carlos
Barba, Jacqueline Hernández, Sergio Rojas, Iván Huerta y Felipe Vaca.













1
Indice.

1. Lista de abreviaciones y simbología…………………………………………................... 5
2. Resumen……………………………………………………………………..…………… 7
3. Introducción
3.1 Las vías metabólicas y su interacción ……………..……………………………........ 8
3.2 El metabolismo energético de la célula …...…………………………......................... 9
3.3 El metabolismo fermentativo en la levadura …..…………………………………….10
3.4 El efecto Crabtree …..……………………………………………………………..…12
3.5 Los mecanismos que conducen al efecto Crabtree.
3.5.1 La limitación de ADP y Pi: Posible papel del potencial fosfato ……..…….13
3.5.2. La reoxidación de los equivalentes reductores citoplásmicos y el potencial
de óxido-reducción ……………………………………………………………… 14
3.5.3. La restricción de la entrada del piruvato al ciclo de Krebs …...………….. 16
3.5.4 La permeabilidad de la membrana externa mitocondrial ……..................... 17
3.5.5. El papel inhibitorio del calcio sobre la respiración …..…………………... 18
3.5.6 Los mensajeros metabólicos …………………………….............................18
4. Objetivo ………………………………………………………………………................ 19
5. Objetivos particulares …………………………………………………………………... 19
6. Hipótesis ………………………………………………………………………………... 20
7. Materiales y métodos
7.1 Cepas y medios de cultivo ………………………………………………...................20
7.2 Obtención de esferoplastos …………………………………………………………..20
7.3 Aislamiento de mitocondrias ……………………………………………...................21
7.4 Determinación del consumo de oxígeno …………………………………………….22
7.5 Cuantificación del potencial transmembranal mitocondrial (∆Ψ)…………………....22
7.6 Determinación indirecta de la actividad del complejo III …………………………...23
7.7 Determinación de la actividad de la citocromo oxidasa (complejo IV) ……………..23
8. Resultados……………………………………………………………………..................24
9. Discusión ………………………………………………………………………………...37
10. Conclusiones …………………………………………………………………………… 41
11. Referencias ……………………………………………………………………………... 42













2
Indice de figuras y tablas.

Figura 1. Efecto de las hexosas fosfato derivadas de la glucólisis sobre la respiración (JO ) de 2
mitocondrias aisladas de levadura en condiciones de no fosforilación ………………………… 25

Figura 2. Efecto de las hexosas fosfato derivadas de la glucólisis sobre la respiración (JO ) de 2
mitocondrias aisladas de levadura en condiciones de fosforilación …………………………… 26

Figura 3. Efecto de la fructosa 1,6-bifosfato sobre el incremento del flujo respiratorio (JO ) 2
mediado por la glucosa 6-fosfato ………………………………………………………………. 27

Figura 4. Actividad del complejo IV en presencia de fructosa 1,6-bifosfato en condiciones de
fosforilación y de no fosforilación ……………………………………………………………… 30

Figura 5. Efecto de las hexosas de la glucólisis sobre la actividad del complejo III
respiratorio………………………………..……………………………………………………... 31

Figura 6. Efecto de la fructosa 1,6-bifosfato sobre la aceleración de la actividad del complejo III
inducida por la presencia de glucosa 6-fosfato …………………………………………………. 33

Figura 7. Efecto de la fructosa 1,6-bifosfato sobre la respiración de esferoplastos
permeabilizados de levadura ……………………………………………………………………. 35

Tabla 1. Potencial transmembranal mitocondrial en presencia de las hexosas fosfato de la
glucólisis ………………………………………………………………………………………... 28

Tabla 2. El efecto Crabtree en la cepa ∆tps1 …...……………………………………………… 36


















3
Anexo I.
“Mitochondrial oxidative phosphorylation is regulated by fructose 1,6-biphosphate. A possible
role in Crabtree effect induction?”
Díaz-Ruiz R, Avéret N, Araiza D, Pinson B, Uribe-Carvajal S, Devin A y Rigoulet M.
J Biol Chem, 2008, 283 (40): 26948-55.

Anexo II.
“Tumor cell energy metabolism and its common features with yeast cell metabolism”
Díaz-Ruiz R, Uribe-Carvajal S, Devin A y Rigoulet M.
Biochim Biophys Acta, 2009, 1796 (2): 252-65.



































4
1. Lista de abreviaciones y simbología.

∆µ : Potencial químico de los protones. H+
∆Ψ: Potencial transmembranal mitocondrial.
∆G : Potencial de óxido-reducción. O/R
∆G : Potencial fosfato. p
∆p: Fuerza protónmotriz.
ADH: Alcohol deshidrogenasa.
ANT: Translocador de nucleótidos de adenina.
BSA: Albúmina sérica de bovino.
CCCP: Carbonil cianuro 3-clorofenilhidrazona.
D.E: Desviación estándar.
EGTA: Acido etilen glicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N’.N’-tetracético.
F16bP: fructosa 1,6-bifosfato.
F6P: fructosa 6-fosfato
3+Fe(CN) : Ferricianuro. 6
G6P: glucosa 6-fosfato.
HK: Hexocinasa.
JO : Flujo respiratorio. 2
L: Coeficiente fenomenológico.
LDH: Lactato deshidrogenasa.
PDC: Piruvato descarboxilasa.
PDH: Complejo de la piruvato deshidrogenasa.
PDHK: Cinasa de la piruvato deshidrogenasa.
PDP: Fosfatasa de la piruvato deshidrogenasa.
Pi: Fosfato inorgánico.
q: Constante de acoplamiento.
Rh-123: Rodamina 123.
T6P: Trehalosa 6-fosfato.
TMPD: N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilendiamina.
5
Tris: Tris(hidroximetil) aminometano.
TPS1: Trehalosa 6-fosfato sintasa.
VDAC: Canal aniónico dependiente de voltaje.
X: Fuerza termodinámica.


























6
2. Resumen.

Cuando la levadura Saccharomyces cerevisiae crece de forma aerobia, la respiración es
inmediatamente reprimida al añadir glucosa al medio de cultivo. A este fenómeno se le ha
denominado “efecto Crabtree”. Se ha reportado que la inhibición del flujo respiratorio es
concomitante con la acumulación citoplásmica de las hexosas fosfato derivadas de la glucólisis.
En este trabajo se empleó a S. cerevisiae para investigar los eventos regulatorios a corto plazo
asociados al efecto Crabtree y el posible papel de las hexosas fosfato en la inhibición de la
respiración. Empleando mitocondrias aisladas de levadura se encontró que la glucosa 6-fosfato y
la fructosa 6-fosfato estimulan el flujo respiratorio. Este efecto fue contrarrestado por
concentraciones fisiológicas de fructosa 1,6-bifosfato, la cual además inhibe la respiración en
ausencia de las otras dos hexosas fosfato. Esto ocurre in situ, ya que el efecto mediado por la
fructosa

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