Towards the development of high affinity InhA and KasA inhibitors with activity against drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis [Elektronische Ressource] = Entwicklung von hoch-affinen InhA- und KasA-Inhibitoren gegen resistente Stämme von Mycobacterium tuberculosis / submitted by Sylvia Rosie Luckner

Sylvia Bénichou-Roubaud

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• Biologie

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• Publié par: julius-maximilians-universitat_wurzburg
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 31
• Langue: English
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Extrait

Towards the development of high affinity InhA and KasA inhibitors with activity
against drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis
Entwicklung von hoch-affinen InhA und KasA Inhibitoren gegen resistente
Stämme von Mycobacterium tuberculosis




Doctoral thesis for a doctoral degree
at the Graduate School of Life Sciences,
Julius-Maximilians-Universität Würzburg,
Section Biomedicine



submitted by
Sylvia Rosie Luckner

from
Nürnberg


Würzburg 2009
















Submitted on: …………………………………………………………..……..
Members of the Promotionskomitee:
Chairperson: Michael Sendtner
Primary Supervisor: Caroline Kisker
Supervisor (Second): Peter Tonge
Supervisor (Third): Thomas Müller
Date of Public Defence: …………………………………………….…………
Date of Receipt of Certificates: ……………………………………………….

iiSUMMARY
Summary
Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of tuberculosis and responsible for more
than eight million new infections and about two million deaths each year. Novel
chemotherapeutics are urgently needed to treat the emerging threat of multi drug resistant and
extensively drug resistant strains.
Cell wall biosynthesis is a widely used target for chemotherapeutic intervention in bacterial
infections. In mycobacteria, the cell wall is comprised of mycolic acids, very long chain fatty
acids that provide protection and allow the bacteria to persist in the human macrophage. The
type II fatty acid biosynthesis pathway in Mycobacterium tuberculosis synthesizes fatty acids
with a length of up to 56 carbon atoms that are the precursors of the critical mycobacterial cell
wall components mycolic acids. KasA, the mycobacterial β-ketoacyl synthase and InhA, the
mycobacterial enoyl reductase, are essential enzymes in the fatty acid biosynthesis pathway
and validated drug targets.
In this work, KasA was expressed in Mycobacterium smegmatis, purified and co-crystallized
in complex with the natural thiolactone antibiotic thiolactomycin (TLM). High-resolution
crystal structures of KasA and the C171Q KasA variant, which mimics the acyl enzyme
intermediate of the enzyme, were solved in absence and presence of bound TLM. The crystal
structures reveal how the inhibitor is coordinated by the enzyme and thus specifically pinpoint
towards possible modifications to increase the affinity of the compound and develop potent
new drugs against tuberculosis. Comparisons between the TLM bound crystal structures
explain the preferential binding of TLM to the acylated form of KasA. Furthermore, long
polyethylene glycol molecules are bound to KasA that mimic a fatty acid substrate of
approximately 40 carbon atoms length. These structures thus provide the first insights into the
molecular mechanism of substrate recognition and reveal how a wax-like substance can be
accommodated in a cytosolic environment.
InhA was purified and co-crystallized in complex with the slow, tight binding inhibitor 2-(o-
+tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70). Two crystal structures of the ternary InhA-NAD -PT70 were
solved and reveal how the inhibitor is bound to the substrate binding pocket. Both structures
display an ordered substrate binding loop and corroborate the hypothesis that slow onset
inhibition is coupled to loop ordering. Upon loop ordering, the active site entrance is more
restricted and the inhibitor is kept inside more tightly. These studies provide additional
information on the mechanistic imperatives for slow onset inhibition of enoyl ACP
reductases.
iiZUSAMMENFASSUNG
Zusammenfassung
Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose ist für mehr als acht Millionen Neu-
Infektionen und ungefähr zwei Millionen Todesfälle jedes Jahr verantwortlich. Besonders die
Entwicklung von multiresistenten und extrem resistenten Stämmen macht die Entwicklung neuer
Medikamente gegen Tuberkulose dringend erforderlich.
Die Zellwandbiosynthese ist ein validiertes Ziel für die Chemotherapie bei bakteriellen
Infektionen. Bei Mycobakterien besteht die Zellwand zum Großteil aus Mykolsäuren, sehr
langkettigen Fettsäuren, die den Bakterien Schutz bieten und ihnen ermöglichen, in Makrophagen
zu überleben. Mycobakterien synthetisieren in der Fettsäurebiosynthese II (FAS-II) Fettsäuren bis
zu einer Länge von 56 Kohlenstoffatomen, die Bestandteile der Mykolsäuren sind. KasA, die
mycobakterielle -ketoacyl Synthase und InhA, die mycobakterielle enoyl Reductase, sind
essentielle Enzyme der FAS-II und geeignete Ziele für die Entwicklung neuer Antibiotika.
In dieser Arbeit wurde KasA in Mycobacterium smegmatis exprimiert und aufgereinigt. Das
Protein wurde im Komplex mit dem natürlich vorkommenden Thiolacton-Antibiotikum
Thiolactomycin (TLM) co-kristallisiert. Kristallstrukturen von KasA und der C171Q KasA
Variante, die das acylierte Enzym-Intermediat darstellt, wurden als apo-Strukturen und im
Komplex mit gebundenem TLM aufgeklärt. Die Kristallstrukturen zeigen, wie der Inhibitor an das
Enzym gebunden ist und deuten darauf hin, wie das TLM Molekül verändert werden könnte, um
seine Affinität für das Protein zu erhöhen und damit ein wirksames Medikament gegen
Tuberkulose zu entwickeln. Vergleiche zwischen den TLM gebundenen Kristallstrukturen
erklären, warum TLM bevorzugt an die acylierte Form des Enzyms bindet. Des Weiteren sind
lange Polyethylenglykol-Moleküle an KasA gebunden, die ein Fettsäuresubstrat einer Länge von
etwa 40 Kohlenstoff-Atomen nachahmen. Die Strukturen geben damit zum ersten Mal einen
Einblick in den molekularen Mechanismus der Substrat-Erkennung und zeigen, wie eine
wachsartige Substanz in einem cytosolischen Umfeld aufgenommen werden kann.
InhA wurde aufgereinigt und im Komplex mit dem „slow binding“ Inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-
+hexylphenol (PT70) co-kristallisiert. Zwei Kristallstrukturen des ternären InhA-NAD -PT70
Komplexes wurden gelöst und zeigen wie der Inhibitor in der Substratbindetasche gebunden ist.
Beide Strukturen, weisen geordnete Substrat-Binde-Loops auf, die den Eingang zur „Active Site“
schließen und damit den gebundenen Inhibitor in der Tasche festhalten. Die Strukturen bestätigen
damit die Hypothese, dass „Slow Binding Inhibition“ mit der Ordnung des Loops
zusammenhängt. Diese Studien können als Basis für die Entwicklung weiterer „Slow Binding“
Inhibitoren verwendet werden.
iii
b
Table of contents
Summary ...................................................................................................................................ii
Zusammenfassung...................................................................................................................iii
Table of contents...................................................................................................................... iv
1 Introduction ...................................................................................................................... 1
1.1 Tuberculosis ............................................................................................................... 1
1.1.1 Mycobacterium tuberculosis .................................................................................. 1
1.1.2 The disease ............................................................................................................. 2
1.1.3 Current treatment against tuberculosis................................................................... 2
1.1.4 Composition of the mycobacterial cell wall........................................................... 4
1.2 Development of novel antibiotics against tuberculosis.............................................. 6
1.2.1 Drug target fatty acid synthesis pathway II............................................................ 7
1.2.2 Beta-ketoacyl synthase KasA................................................................................. 8
1.2.3 Enoyl reductase InhA ............................................................................................. 9
1.2.4 Inhibitors of KasA and InhA................................................................................ 10
1.3 Research objectives .................................................................................................. 13
2 Material and methods .................................................................................................... 14
2.1 Material.................................................................................................................... 14
2.1.1 Bacterial strains and plasmids.............................................................................. 14
2.1.2 Media and antibiotics ........................................................................................... 14
2.1.3 Chemicals ............................................................................................................. 14
2.1.4 Relevant buffers and solutions ............................................................................. 14
2.1.5 Crystallization screens......................................